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type: doctoralThesis
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creators_name: Khachaturyan, Galina
title: The role of Protein Kinase D signaling and the thermal microenvironment on single cell migration
subjects: 500
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adv_faculty: af-12
abstract: Cell migration plays an essential role in development and homeostasis. This extraordinarily complex process, which is dynamically regulated by a coordinated interplay between the extracellular environment and intracellular signaling pathways, can also cause the emergence of disease states when dysregulated. A prominent example is cancer metastasis, which is the
leading cause of cancer-related mortality. Despite an increasing body of literature focused on cell migration, many aspects remain unclear. In the current work, two complementary systematic in vitro cell migration studies were performed to gain insights into both healthy immune cell migration and pathological cancer cell migration. 

Temperature-dependent neutrophil migration was analyzed using differentiated HL-60 cells as a model cell line. Neutrophils are the first cells to be activated during inflammation and subsequently migrate toward an injured tissue or infection site. This response is dependent on both biochemical signaling and the extracellular environment, one aspect of which includes increased temperature in the tissues surrounding the inflammation site. The results of this study reveal a positive correlation between the average speed of randomly migrating cells and temperatures from 30 ˚C to 42 ˚C. Higher temperatures also induce a concomitant increase in cell detachment. Further analysis of the migration data showed that persistence time is higher at low temperatures, while migration persistence length remains constant throughout the temperature range. Coupled with the increased speed observed at elevated temperatures, the obtained results indicate the ability of neutrophils to adapt their migration characteristics to the temperature in order to maintain relatively constant persistence length. As temperature gradients exist on both cellular and tissue scales, the ability of the HL-60 cells to sense and react to the presence of temperature gradients, a process known as thermotaxis, was also investigated. Towards this aim, a two-dimensional temperature gradient chamber was developed. In a gradient with the range of 27-43 ˚C both positive and negative thermotaxis was observed with cells migrating both to the high and the low temperature sources. To date, thermotaxis in neutrophil differentiated HL-60 cells has never been reported.

Next, an in-depth in vitro migration study was carried out on Panc1 pancreatic cancer cells to elucidate the role of Protein Kinase D (PKD) in cancer cell migration. CRISPR-mediated knockouts of PKD1, 2, and 3 in Panc1 cells were used to investigate isoform-specific effects on cancer cell invasion-related motility. The data presented in this project reveals that absence of each PKD isoform plays a significant role in cell speed and migration persistence. To investigate the pancreatic cancer PKD isoform-dependent contact guidance, a panel of more complex PDMS-based substrates containing microgrooves of different heights and widths
was utilized. These experiments further demonstrate pancreatic cancer cell shape, speed, and contact guidance dependence on the presence of different PKD isoforms. Based on these findings, in combination with previous works showing that contact guidance is affected by cell viscoelasticity, mechanical properties of each PKD isoform knockout cell line were also measured using a laser-based optical cell stretcher. These experiments showed a significant increase in Panc1 cell deformability in the absence of PKD1, demonstrating for the first time PKD involvement in regulation of cellular mechanical properties. Finally, these basic
mechanical properties were correlated to MMP - independent confined migration, which is required for cells to metastasize in vivo.
abstract_translated_text: Die Migration von Zellen spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung und Homöostase von Geweben, Organen und Organsimen. Der komplexe Prozess der Zellmigration, der durch ein koordiniertes Zusammenspiel aus Signalen zwischen der extrazellulären Umgebung und den intrazellulären Signalwegen dynamisch reguliert wird, kann bei verschiedenen Erkrankungen
auch fehlreguliert sein. Ein prominentes Beispiel hierfür ist die Metastasierung von Krebs, ein Prozess, der die Hauptursache der krebsbedingte Mortalität darstellt. Trotz der zunehmenden Anzahl an Literatur, die sich thematisch auf die Tumorzellmigration konzentriert,
sind viele Aspekte der Zellmigration noch unklar. In der Arbeit zu dieser Dissertation wurden zwei komplementäre systematische Zellmigrationsstudien durchgeführt, um Einblicke in die Immunzellmigration und die pathologische Krebszellmigration zu erhalten.

Die temperaturabhängige Migration von Neutrophilen Granulozyten wurde unter Verwendung differenzierter HL-60-Zellen als Modellzelllinie analysiert. Periphere Neutrophile im Blut sind die ersten Zellen, die während einer Entzündung aktiviert werden und anschließend in Richtung eines verletzten Gewebes oder einer Infektionsstelle wandern, ebenso reichern sie sich in Tumoren an. Diese gerichtete Migration hängt sowohl von biochemischen Signalen, als auch von physikalischen Eigenschaften und Signalen der extrazellulären Umgebung ab. Interessanterweise zeigen Geweben um Entzündungsstelle herum eine erhöhte Temperatur und haben somit zum umliegenden Gewebe auch einen Temperaturgradienten. Allerdings ist
wenig über die Migration von Zellen, insbesondere Granulozyten bei erhöhter Temperatur oder in solchen Temperaturgradienten bekannt. Die hier beschriebene in vitro Untersuchung zeigt, dass die Migrationsgeschwindigkeit positiv mit der Erhöhung der Temperatur zwischen 30 ˚C und 42 ˚C, korreliert. Die Persistenz-Zeit der Migration war bei niedrigen Temperaturen höher als bei hohen Temperaturen, während das Produkt aus mittlerer Geschwindigkeit und Persistenz-Zeit, also ein Maß für die Persistenzlänge, im gesamten Temperaturbereich etwa konstant blieb. Da Temperaturgradienten sowohl auf Zell- als auch auf Gewebeebene existieren, wurde darüber hinaus die Fähigkeit der Zellen untersucht, auf Temperaturgradienten zu reagieren. Unter Verwendung einer zweidimensionalen Temperatur-Gradientenkammer mit einer Temperaturdifferenz von 27–43 ˚C wurde sowohl positive als auch negative Thermotaxis bei den HL-60 Zellen beobachtet. 

Des Weiteren wurde eine detaillierte biophysikalische in-vitro-Migrationsstudie mit Panc1 Bauchspeicheldrüsenkrebszellen durchgeführt, um die Rolle verschiedener Isoformen der Protein Kinase D (PKD) bei der Migration besser zu verstehen. Dazu wurden CRISPR-vermittelte
Knockouts von PKD1, 2 und 3 in Panc1-Zellen verwendet, um isoform-spezifischer Effekte auf das invasive Verhalten der Zellen zu untersuchen. Der spezifische knock-down jeder einzelnen PKD-Isoform hatte Einfluss auf die Migrationsgeschwindigkeit und die Zellmorphologie, sowie auf die Fähigkeit der Zellen, durch enge Mikrokanäle (Confinement) zu wandern.
Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Zellmorphologie, die Migrationsgeschwindigkeit und die sogenannte Contact Guidance, die Migration und Orientierung entlang von Mikrotopographien
von der Präsenz der verschiedenen PKD-Isoformen beeinflusst wird. Da frühere Arbeiten zeigen, dass das Contact Guidance Verhalten durch die Viskoelastizität der Zellen beeinflusst wird, wurden die mechanischen Eigenschaften der PKD-Isoform-Knockout-Zellen mit einem lasergestützten optischen Zellstrecker bestimmt. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante
Zunahme der Verformbarkeit von Panc1-Zellen in Abwesenheit von PKD1, jedoch weitaus geringere Veränderungen beim Knock-Down der beiden anderen Isoformen. Somit scheint PDK1 in Panc1-Zellen singulär zellmechanische Eigenschaften zu verändern, die für die Migration wichtig sind.
abstract_translated_lang: ger
date: 2020
id_scheme: DOI
id_number: 10.11588/heidok.00026531
ppn_swb: 1686888082
own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-heidok-265317
date_accepted: 2019-01-25
advisor: HASH(0x564e1c3f2df0)
language: eng
bibsort: KHACHATURYTHEROLEOFP2020
full_text_status: public
citation:   Khachaturyan, Galina  (2020) The role of Protein Kinase D signaling and the thermal microenvironment on single cell migration.  [Dissertation]     
document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/26531/1/Thesis_Galina%20Khachaturyan.pdf