title: Hepatitis B Virus X protein-mediated transcription of covalently closed circular DNA and its inhibition by blocking neddylation
creator: Qu, Bingqian
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: Das Hepatitis B Virus (HBV) kann zu chronischer Leberinfektion führen und ist ein Risikofaktor für die Entstehung von Leberzirrhose und dem hepato-zellulären Karzinom. Für die Persistenz des Virus ist die Bildung und die Aufrechterhaltung der kovalent geschlossenen  zirkulären DNS („covalently closed circular“ (ccc)DNS) zwingend notwendig, da sie als episomale Matrize für die Transkription im Kern der infizierten Hepatozyten dient. Die an cccDNS gebundene virale Transkription hängt vom HBV X Protein (HBx) sowie den durch HBx initiierten Abbau des wirtsspezifischen Restriktionsfaktors „structural maintenance of chromosome 5/6“ (SMC5/6) ab. Eine Grundvoraussetzung für die Ubiquitinierung und den  Abbau von SMC 5/6 ist, dass HBx das Protein “DNA damage-binding protein1“ (DDB1) bindet und somit den Cullin 4A Ringligasekomplex rekrutiert, welcher für seine Aktivierung  neddyliert werden muss.    Nachdem eine verlässliche quantitative PCR etabliert wurde konnte die Kinetik der cccDNS Bildung in vier verschiedenen in vitro Infektionsmodellen sowie der Einfluss von  Medikamenten (Interferon-α, Nukleos(t)id-Analoga,Inhibitoren des viralen Zelleintritts(„entry Inhibitor“) und Kapsid-Inhibitoren) auf die cccDNS untersucht werden. Im Vergleich  zum Replikationsintermediat der gelockerten zirkulären („relaxed circular“; (rc)DNS) sind die Kopienzahlen der cccDNS in infizierten Hepatozyten niedrig (1-6 Kopien/infizierter Zelle). Der „entry Inhibitor“ Myrcludex B unterband effizient die (ccc)DNS Bildung. Hohe Interferon-α  Dosen verringerten die cccDNS Menge während Nukleos(t)id-Analoga diese nicht vermindern konnten. Die Gabe von Kapsid Inhibitoren während der Infektionsphase, aber nicht zu einem  späteren Zeitpunkt, führte zu einer Verringerung der cccDNS Menge.    Indem wir HBx negative Virionen für die Infektion verwendet haben, konnten wir die Schlüsselrolle von HBx in der Kontrolle der cccDNS Transkription verifizieren. Wird HBx  transient von einem authentischen Promotor exprimiert befindet es sich im Zellkern. Mit Hilfe eines lentiviral basierten Transkomplementationsansatzes, in dem die Transkription von HBx defizienten Virionen auf das Level von Wildtypviren gehoben wurde, konnten Schlüsselfragmente und -bereiche des HBx bestimmt werden. Der gesamte C-Terminus von HBx (Aminosäuren 51-154) war sowohl ausreichend als auch unentbehrlich um die Replikation HBx-defizienter Viren wieder herzustellen während der N-Terminus (Aminosäuren 1-50) keine transaktivierende Funktion aufzeigte. Zusätzlich waren zwei kürzere Fragmente (Aminosäure 51-142 und 58-142) teilweise funktional. Bemerkenswerterweise wies die HBx Mutante(R96E), welche nur noch eine geringe Bindeaktivität zu DDB1 aufweist, überhaupt keine Transaktivierungsaktivität mehr auf, was darauf hindeutet, dass die Bildung des HBx-DDB1 Komplexes für die maximal mögliche Transkription der cccDNS nötig ist.    Des Weiteren untersuchten wir ob eine Hemmung der Neddylierung die Transkription erschwert. MLN4924, ein spezifischer Inhibitor des NEDD8-aktivierenden Enzyms 1 zeigte ein bemerkenswertes antivirales Potenzial. MLN4924 verringerte die HBV Transkription und virale Antigenexpression wirksam in nanomolarer Dosierung. Nach der Bildung der cccDNS unterdrückte das Medikament hochgradig die Transkription selbiger ohne dabei die cccDNS Menge zu beeinflussen. Die Unterbrechung der MLN4924 Gabe führte in HepaRGNTCP Zellen nicht zu einer Reaktivierung der cccDNS Transkription, wohingegen in HepG2NTCP Zellen eine schnelle Erholung von HBV beobachtet wurde. Bemerkenswerter Weise wurde die Transkription der cccDNS HBx-defizienter Viren nicht signifikant beeinfluss, was darauf schließen lässt, dass der MLN4924 Effekt auf das Wildtypvirus HBx-abhängig ist. MLN4924 verringert dabei selektiv die Transkription aller HBV Promotoren im Kontext der cccDNS, jedoch nicht bei integrierter viraler DNA. MLN4924 verhinderte der Abbau von SMC6,förderte dessen Wiederherstellung und unterband somit die Transkription der cccDNS.    Zusammenfassen lässt sich sagen, dass nukleäres HBx DDB1 bindet, den Abbau von SMC6 induziert und so die Transkription der cccDNS fördert. Ein Angriff auf die Neddylierung unterbindet die Transkription der cccDNS und stellt die SMC6-abhängige Restriktion der cccDNS wieder her. Somit friert eine MLN4924 Behandlung die cccDNS in einem Zustand der „transkriptionellen Stille“ ein. Kleine Moleküle, die auf den HBx-DDB1-Cullin Komplex zielen könnten somit eine Vorausschau auf die nächstmögliche Therapie für HBV sein.
date: 2020
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/27472/1/Bingqian%20Qu%20doctorate%20dissertation%202019-08-26.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00027472
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-heidok-274728
identifier:   Qu, Bingqian  (2020) Hepatitis B Virus X protein-mediated transcription of covalently closed circular DNA and its inhibition by blocking neddylation.  [Dissertation]     
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language: eng