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datestamp: 2022-01-24 12:30:34
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status_changed: 2022-01-24 12:30:34
type: doctoralThesis
metadata_visibility: show
creators_name: Uhler, Rico
title: Glyco-engineered HEK 293-F cell lines to produce therapeutic
glycoproteins with human N-glycosylation and improved pharmacokinetics
subjects: ddc-570
subjects: ddc-600
subjects: ddc-610
divisions: i-61002
adv_faculty: af-06
keywords: Biotechnology
Glycobiology
cterms_swd: Glycobiology
cterms_swd: Biotechnology
abstract: Using human cell lines for the production of therapeutic proteins can be beneficial due to their ability to
generate fully human post-translational modifications. HEK 293 cells are an efficient expression system
with a record of approved therapeutic protein products. However, the presence of
N-acetylgalactosamine, the low sialylation on N-glycans of recombinant HEK 293 cell-derived
glycoproteins and the resulting efficient clearance via glycan receptors in patients—namely the
asialoglycoprotein receptor and the mannose receptor—currently limits its use in therapeutic protein
production.
To be able to produce recombinant proteins without N-acetylgalactosamine on their N-glycans,
HEK 293-F clones featuring a functional KO of both the B4GALNT3 and B4GALNT4 genes were
generated. Subsequently, to increase the sialylation, sialyltransferases ST6GAL1 and ST3GAL6 were
overexpressed by gene knock-in. The model protein factor VII-albumin was expressed in these new host
cell lines to evaluate the phenotypic changes induced by the described glyco-engineering. Furthermore,
medium supplementation with N-acetylmannosamine and cytidine was tested to improve sialylation.
HEK 293-F cells with B4GALNT3 and B4GALNT4 knock-out produced factor VII-albumin devoid of
N-acetylgalactosamine and sulfated N-acetylgalactosamine, with reduced antenna fucosylation and
increased antennarity, bisecting N-acetylglucosamine as well as sialylation. Overexpression of
ST6GAL1 or ST3GAL6 further increased sialylation and reduced antenna fucosylation, while
sialylation was not affected by medium supplementation of sialic acid metabolism precursors
N-acetylmannosamine and cytidine. Factor VII-albumin produced in the double N-acetylgalactosamine
transferase knock-out cell line with simultaneous ST6GAL1 knock-in showed a level of sialylation
similar to that of plasma-derived factor VII and higher than that of factor VII from CHO or BHK cells.
As a result, asialoglycoprotein and mannose receptor binding of glyco-engineered factor VII-albumin
variants was abolished in vitro and pharmacokinetic properties were improved in vivo.
To determine whether the detected changes in N-glycosylation were specific for factor VII-albumin or
whether the results are applicable to other proteins, B domain-deleted factor VIII and factor IX were
expressed in the wild-type HEK 293-F cell line, the double N-acetylgalactosamine transferase knockout
clone and the double N-acetylgalactosamine transferase knock-out clone with ST6GAL1 knock-in.
Despite considerable differences in the N-glycosylation profiles of the three proteins, the effects of the
applied glyco-engineering were largely comparable.
Thus, these new glyco-engineered cell lines are suitable for the expression of fully human therapeutic
proteins with favorable N-glycosylation and improved pharmacokinetic properties.
abstract_translated_text: die Produktion von therapeutischen Proteinen mit humanen posttranslationalen Modifikationen
stellen humane Zelllinien ein vorteilhaftes System dar. HEK 293-F Zellen sind ein effizientes
Expressionssystem, das schon von regulatorischen Behörden zur Produktion von therapeutischen
Proteinen zugelassen wurde. Allerdings sind N-Glykane von Proteinen, die in HEK 293 Zellen
produziert werden, besetzt mit N-Acetylgalactosamin und tragen wenige Sialinsäuren, was in Patienten
zum schnellen Abbau der Proteine durch Glykanrezeptoren wie dem Asialoglykoproteinrezeptor oder
dem Mannose Rezeptor führt. Dadurch ist die Produktion von therapeutischen Proteinen in HEK 293
Zellen auf solche beschränkt, die diese Glykanstrukturen nicht tragen.
Um Proteine ohne N-Acetylgalactosamin produzieren zu können, wurden HEK 293-F Zellen, in denen
die Enzyme B4GALNT3 und B4GALNT genetisch deaktiviert wurden, hergestellt. Um die Sialylierung
zu erhöhen, wurden anschließend die Sialyltransferasen ST6GAL1 und ST3GAL6 durch eine
Geninsertion überexprimiert. In den entstandenen Zelllinien wurde das Modellprotein
Faktor VII-Albumin exprimiert und es wurden die phänotypischen Veränderungen analysiert, welche
durch die angewandte Glyko-Optimierung induziert wurden.
HEK 293-F Zellen ohne funktionelles B4GALNT3 und B4GALNT4 stellten Faktor VII-Albumin ohne
N-Acetylgalaktosamin und sulfatiertem N-Acetylgalaktosamin, mit reduzierter Antennenfukosylierung
und mit erhöhter Antennarität, bisecting N-Acetylglukosamin und Sialylierung her. Die Überexpression
von ST6GAL1 oder ST3GAL6 führte zu einer weiteren Erhöhung der Sialylierung und Reduzierung der
Antennenfukosylierung. Dagegen hatte die Zugabe von N-Acetylmannosamin und Cytidin, Vorläufer
des Sialinsäuremetabolismus, zum Kulturmedium keinen Effekt auf die Sialylierung.
Faktor VII-Albumin, das in der Zelllinie ohne B4GALNT3- und B4GALNT4-Aktivität aber mit
ST6GAL1-Überexpression hergestellt wurde, zeigte eine ähnlich hohe Sialylierung wie Faktor VII aus
humanem Plasma und eine höhere als FVII aus CHO oder BHK Zellen. Glyko-optimierte
Faktor VII-Albumin-Varianten zeigten eine reduzierte Bindung an den Asialoglykoproteinrezeptor und
den Mannose Rezeptor in vitro und verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften in vivo.
Um festzustellen ob die detektierten Änderungen der N-Glykosylierung spezifisch für
Faktor VII-Albumin sind, oder ob die Ergebnisse auch auf andere Protein übertragbar sind, wurde ein
Faktor VIII Molekül ohne B-Domäne und ein Faktor IX Molekül in Wildtyp HEK 293-F Zellen
hergestellt, sowie in HEK 293-F Zellen ohne funktionelles B4GALNT3 und B4GALNT4 und in HEK
293-F Zellen ohne funktionelles B4GALNT3 und B4GALNT4 aber mit überexprimiertem ST6GAL1.
Obwohl sich die N-Glykosylierung der drei Proteine grundlegend unterscheidet, waren die
Veränderungen durch die angewendete Glyko-Optimierung in allen drei vergleichbar.
Die neuen, glyko-optimierten Zelllinien sind daher für die Herstellung von vollständig humanen
Proteinen mit vorteilhafter N-Glykosylierung und verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften
geeignet.
abstract_translated_lang: ger
date: 2022
id_scheme: DOI
id_number: 10.11588/heidok.00031087
ppn_swb: 1787121100
own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-heidok-310877
date_accepted: 2021-12-03
advisor: HASH(0x55de579c75f8)
language: eng
bibsort: UHLERRICOGLYCOENGIN2022
full_text_status: public
place_of_pub: Heidelberg
citation:   Uhler, Rico  (2022) Glyco-engineered HEK 293-F cell lines to produce therapeutic glycoproteins with human N-glycosylation and improved pharmacokinetics.  [Dissertation]     
document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/31087/1/PhD%20Thesis%20Rico%20Uhler.pdf