eprintid: 33518 rev_number: 20 eprint_status: archive userid: 7303 dir: disk0/00/03/35/18 datestamp: 2024-07-15 09:57:24 lastmod: 2024-07-15 14:27:34 status_changed: 2024-07-15 09:57:24 type: doctoralThesis metadata_visibility: show creators_name: Kling, Christopher title: A Molecular Flip: How Polyols Affect the Stability and Activity of an Industrial Relevant Subtilisin Protease in Liquid Formulations subjects: ddc-500 subjects: ddc-540 subjects: ddc-570 divisions: i-160100 adv_faculty: af-19 cterms_swd: Enzyme cterms_swd: Formulierung cterms_swd: Stabilisierung cterms_swd: Simulation cterms_swd: Enzymatische Aktivität cterms_swd: IR-Spektroskopie abstract: Due to their natural origin, enzymes are highly adapted to the physiological conditions in living systems. Thus, their application in industrial processes is often hindered by insufficient stability. In addition to the targeted modification of the enzyme structure, immobilization on surfaces, or encapsulation, targeted adjustment of the surrounding medium can contribute to increased enzyme stability. Consequently, osmolytes such as polyols are added to liquid formulations after fermentation, in downstream processing or before storage. This is to ensure the highest level of stability and prolonged activity. Storage stability is monitored by determining the active enzyme content at several points in time. This allows the effect of different additives to be compared with each other. In this context, the MIRA infrared spectrometer was validated as an alternative to conventional photometric assays and analytical methods for determining the enzyme/solvent concentration. MIRA combines classical IR spectroscopy and AI-based approaches for the reproducible quantification of analytes in aqueous environments. By using multivariate data analysis and the developed workflow to reduce the influence of the solvent signal by using difference spectra and external parameter orthogonalization (EPO), PCR/PLS models with a so far unmatched accuracy could be generated based on different subtilisin protease/endocellulase formulations with 1,2-propanediol. The determination of enzyme/solvent concentration in liquid formulations by means of IR spectroscopy is a completely new approach that has several advantages over conventional methods. These include a missing need for sample processing, the speed of the method and the high information content of a measurement, which in combination with modern data processing makes additional analytical methods obsolete. Since differences in storage tests, dependent on the enzyme and formulation, only become apparent after days, weeks or months, the determination of thermal stability by differential scanning calorimetry (DSC) has established itself as an alternative. However, the thermal stability in formulations, especially for proteases, can only be partially matched with storage test results. The reason for this discrepancy was to be investigated further using DSC measurements, molecular dynamic (MD) simulations and long-term storage test studies. In this context, the influence of polyols (including glycerol, sorbitol and 1,2-propanediol) and their concentration (10-50 wt%) on the thermal and long-term stability of a subtilisin protease was evaluated. The determined Tm values of the DSC measurements showed a strong linear correlation with molecular descriptors of the MD simulations. In contrast, no correlation could be determined between DSC and storage test results. While a possible influence of the polyols on the number of bound calcium ions and thus on enzyme stability/activity was not confirmed, an inhibitory effect of smaller/hydrophobic polyols on Km and Vmax in the presence of the artificial protease substrate Suc-AAPF-pNA could be demonstrated by the characterization of enzyme kinetics. SDS-PAGE analyses further allowed to determine the contribution of autoproteolysis to the total loss of active enzyme in the storage test samples and thus to demonstrate the interaction between thermal unfolding and autoproteolysis. Based on the MD trajectories, a flipping of the catalytic histidine side chain and an associated increase in the distance between the catalytic histidine Nε2 and serine Oγ depending on the size and hydrophilicity/hydrophobicity of the polyols could be determined as a possible cause. Consequently, it could be demonstrated, for the first time, that polyols, in addition to their partial stabilizing effect on the enzyme structure, can have an influence on the catalytic activity or autolysis of proteases. Since this effect is not evident in DSC measurements, the results obtained provide new insights into the discrepancy between DSC and storage test results. Based on this, new approaches in the field of enzyme stabilization and furthermore new ideas for the targeted adaptation of the enzyme structure to different formulation environments arise. abstract_translated_text: Enzyme weisen aufgrund ihres natürlichen Ursprungs eine hohe Anpassung an die physiologischen Bedingungen in lebenden Systemen auf. Folglich steht ihrer Anwendung in industriellen Prozessen häufig eine zu geringe Stabilität entgegen. Neben der gezielten Modifikation der Enzymstruktur, Immobilisation an Oberflächen, oder Einkapselung, kann die gezielte Anpassung des umgebenden Mediums zu einer erhöhten Enzymstabilität beitragen. Dementsprechend werden Flüssigformulierungen nach der Fermentation, im Downstream Processing oder vor der Lagerung, Additive wie Polyole zugesetzt. Dadurch soll eine möglichst hohe Stabilität und langanhaltende Aktivität sichergestellt werden. Die Lagerstabilität wird durch die Bestimmung des aktiven Enzymgehaltes zu mehreren Zeitpunkten überprüft. Dadurch lässt sich der Effekt verschiedener Additive untereinander vergleichen. Als Alternative zu herkömmlichen photometrischen Assays und analytischen Methoden galt es in diesem Zusammenhang das MIRA-Infrarot-Spektrometer zur Bestimmung der Enzym-/Lösungsmittelkonzentration zu validieren. MIRA vereint klassische IR-Spektroskopie und KI-gestützte Ansätze zur reproduzierbaren Quantifizierung von Analyten in wässrigen Umgebungen. Durch die Verwendung multivariater Datenanalyse und des entwickelten Arbeitsablaufs zur Reduzierung des Einflusses des Lösungsmittelsignals durch die Verwendung von Differenzspektren und External Parameter Orthogonalization (EPO), konnten auf Basis verschiedener Subtilisin- Protease/Endocellulase-Formulierungen mit 1,2-Propandiol, PCR/PLS-Modelle mit einer bislang unerreichten Genauigkeit generiert werden. Bei der Bestimmung der Enzym-/Lösungsmittelkonzentration in Flüssigformulierungen mittels IR-Spektroskopie handelt es sich um einen vollständig neuen Ansatz, der im Vergleich zu herkömmlichen Methoden mehrere Vorteile aufweist. Dazu gehören eine fehlende Notwendigkeit der Probenverarbeitung, die Schnelligkeit der Methode und der hohe Informationsgehalt einer Messung, der in Kombination mit moderner Datenverarbeitung weitere Messmethoden überflüssig macht. Da Unterschiede in Lagertests, je nach Enzym und Formulierung, erst nach Tagen, Wochen oder Monaten ersichtlich werden, hat sich die Bestimmung der thermischen Stabilität mittels dynamischer Differenzkalorimetrie (DSC) als Alternative etabliert. Allerdings ist die thermische Stabilität in Formulierungen, insbesondere bei Proteasen, nur bedingt mit Lagertestergebnissen in Einklang zu bringen. Die Ursache für die Diskrepanz galt es anhand von DSC-Messungen, Molekulardynamik (MD)-Simulationen und Langzeitlagertest-Studien näher zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde der Einfluss von Polyolen (u.a. Glycerin, Sorbitol und 1,2-Propandiol) und deren Konzentration (10-50 wt%) auf die thermische sowie Langzeitstabilität einer Subtilisin Protease bestimmt. Die ermittelten Tm-Werte der DSC-Messungen zeigten eine starke lineare Korrelation mit molekularen Deskriptoren der MD-Simulationen. Zwischen DSC- und Lagertest-Ergebnissen konnte hingegen kein Zusammenhang ermittelt werden. Während sich ein möglicher Einfluss der Polyole auf die Anzahl der gebundenen Calcium-Ionen und damit auf Enzymstabilität/-aktivität nicht festgestellt werden konnte, konnte über Enzymkinetiken eine inhibitorische Wirkung von kleineren/hydrophoberen Polyolen auf Km und Vmax in Gegenwart des künstlichen Protease-Substrats Suc-AAPF-pNA nachgewiesen werden. SDS-PAGE-Analysen ermöglichten es zudem den Anteil der Autoproteolyse am Gesamtverlust aktiven Enzyms in den Lagertestproben zu bestimmen und damit die Wechselwirkung zwischen thermischer Entfaltung und Autoproteolyse nachzuweisen. Anhand der MD-Trajektorien konnte ein Umklappen der katalytischen Histidin-Seitenkette und eine damit verbundene Vergrößerung des Abstandes zwischen dem katalytischen Histidin-Nε2 und Serin-Oγ in Abhängigkeit der Größe und Hydrophilie/Phobie der Polyole als mögliche Ursache bestimmt werden. Folglich konnte erstmals der Nachweis erbracht werden, dass Polyole - neben ihrer teilweise stabilisierenden Wirkung auf die Enzymstruktur - einen Einfluss auf die katalytische Aktivität bzw. Autolyse von Proteasen haben können. Da dieser Effekt in DSC-Messungen nicht ersichtlich wird, liefern die erzielten Ergebnisse neue Erkenntnisse bezüglich der Diskrepanz zwischen DSC- und Lagertestergebnissen. Darauf aufbauend ergeben sich neue Ansätze im Bereich der Enzymstabilisierung und darüber hinaus neue Ideen für die gezielte Anpassung der Enzymstruktur an verschiedene Formulierungsumgebungen. abstract_translated_lang: ger date: 2024 id_scheme: DOI id_number: 10.11588/heidok.00033518 ppn_swb: 1895470706 own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-heidok-335182 date_accepted: 2023-06-29 advisor: HASH(0x55fc36c8c028) language: eng bibsort: KLINGCHRISAMOLECULAR20230712 full_text_status: public place_of_pub: Heidelberg citation: Kling, Christopher (2024) A Molecular Flip: How Polyols Affect the Stability and Activity of an Industrial Relevant Subtilisin Protease in Liquid Formulations. [Dissertation] document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/33518/1/Dissertation_Christopher_Kling_29_06_2023.pdf