%0 Generic
%A Schröder, Michael
%D 2002
%F heidok:3371
%K Dihydroorotase , solanaceae , Nukleotidnucleotides , de-novo synthesis , potato , metabolism , antisense
%R 10.11588/heidok.00003371
%T Untersuchungen zur pflanzlichen Pyrimidin de-novo Synthese : Bedeutung des Enzyms Dihydroorotase
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/3371/
%X Durch heterologe Komplementation von E.coli Knockout -Mutanten wurde das für Dihydroorotase kodierende Gen aus Solanum tuberosum und Arabidopsis thaliana kloniert. Beide Sequenzen kodieren für das in vivo funktionelle Protein. Im Falle der Kartoffel DHOase wurde durch RACE-PCR die vollst‰ndige untranslatierte 5'-Region (5'-UTR) ermittelt. Mit Hilfe spezieller Suchalgorithmen wurden mit dieser Information Rückschlüsse auf die kontrovers diskutierte subzelluläre Lokalisation des Enzyms in vivo gezogen. Die bisherige Meinung, DHOase sei im Plastiden lokalisiert, erscheint hiernach wenig wahrscheinlich. Durch transiente Genexpression, vermittelt durch Partikelbeschuss, konnten zwei unterschiedliche DHOase:GFP Fusionsproteine mit Confocaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) im Cytosol von Arabidopsis Epidermiszellen nachgewiesen werden. Somit muß die chloroplastidäre Lokalisation der DHOase in Frage gestellt werden und diese statt dessen als cytosolisch postuliert werden. Die Entwicklung eines hochsensitiven Fluorimetrischen Enzymassays ermöglichte die nichtradioaktive Bestimmung der DHOase Aktivität in pflanzlichem Gewebe. Erstmals konnte somit ohne aufwendige Reinigungsprozeduren pflanzliche DHOase in Bezug auf pH-Optimum und Michaelis-Menten Konstante charakterisiert werden. Zur Untersuchung der Bedeutung der Pyrimidin de-novo Synthese wurden transgene Pflanzen mit reduzierter DHOase Expression hergestellt. Vermittelt durch die Antisense-Technik konnten Pflanzen mit verschieden stark ausgeprägter Reduktion der DHOase Expession isoliert werden. Diese wurden in Hinblick auf Metabolismus,Wachstum, Biomasse und Zelldichte untersucht. Es zeigte sich, dass bei starker Reduktion der DHOase Expression die Zellteilung deutlich vermindert ist und in Folge des geringeren Wachstums Kohlehydrate anstauen. Folglich kann durch endogene oder exogene Inhibierung der DHOase das Wachstum der Pflanze effektiv unterbunden werden. In zwei weiteren Ansätzen wurden Kartoffelpflanzen mit dem für DHOase kodierenden Gen aus E.coli transformiert, welches unter Kontrolle des CaMV 35S-, bzw. des B33-Patatin Promotors steht. In Transformanten beider Linien wurden bis zu einhundertfach erhöhte DHOase Aktivitäten gemessen. Eine Steigerung des Pflanzenwachstums oder des Knollenertrages infolge der erhöhten DHOase Expression wurde jedoch nicht beobachtet.