title: Analyse Neurone-generierender Zellteilungen im Neuroepithel der Maus
creator: Haubensak, Wulf Eckhard
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: In Vertebraten wird Dauer der Proliferationsphase neuronaler Vorläuferzellen im Neuroepithel (Neuroepithelzellen) und damit die Neuronenzahl des Gehirns vermutlich durch den Übergang von im cell fate symmetrischen, proliferativen (Generierung zweier Neuroepithelzellen) zu asymmetrischen differenzierenden Zellteilungen (Generierung einer Neuroepithelzelle und eines Neurons) kontrolliert. Direkte Beweise für die Existenz dieser asymmetrischen Teilungen stehen noch aus, genauso wie zellbiologische Mechanismen und genetische Kontrolle des „Umschaltens“ unbekannt sind. Durch die Expression von GFP unter Kontrolle regulatorischer Sequenzen des TIS21-Gens wurden spezifisch Neurone-generierende Neuroepithelzellen markiert, um (i) die Symmetrie der Neurone-generierenden Zellteilung videomikroskopisch zu untersuchen und (ii) eine differenzielle Analyse der Zellbiologie (z.B. Verteilung apikaler Membran, Zellzyklusdauer) und Genexpression von proliferierenden vs. Neurone-generierenden Neuroepithelzellen zu ermöglichen. Es wurden drei transgene und eine TIS21-GFP-knock in-Mauslinie etabliert. Im TIS21-GFP-knock in ersetzt eine GFP-Expressionskassette das offene Leseraster von TIS21 in Exon 1. Der TIS21-GFP-knock in exprimiert entlang des ganzen Neuralrohrs GFP in Neurone-generierenden Neuroepithelzellen, die transgenen Linien jeweils nur in bestimmten Abschnitten. Die Expression von TIS21 im Neuroepithel wird offensichtlich von verschiedenen Elementen gesteuert, die jeweils bestimmte Regionen im Neuralrohr abdecken. In Schnittkulturen von Neuralrohr-Explantaten aus TIS21-GFP-knock in-Embryonen wurden mit Multiphoton-Videomikroskopie zu Beginn der Neurogenese (E12 Telencephalon) neben sich apikal teilenden Zellen auch überraschend Zellen entdeckt, die sich auf der basalen Seite des Neuroepithels teilen. Apikalen Teilungen bilden wahrscheinlich ein Neuron und eine Neuroepithelzelle, basale bilden zwei Neurone. Demnach existieren in Vertebraten  zwei Typen Neurone-generierender Teilungen: (i) im cell fate asymmetrische, apikale Teilungen typischer Neuroepithelzellen und (ii) symmetrische, basale Teilungen einer hier erstmals beschriebenen Zellpopulation. Die Verteilung apikaler Membran und die Zellzykluslänge wurden in proliferierenden vs. Neurone-generierenden Neuroepithelzellen als mögliche Steuerungsmechanismen des Übergangs von Proliferation zu Neurogenese untersucht. Die Orientierung der Teilungsebene (abgeleitet aus der Chromatinfärbung in der Anaphase) relativ zur apikalen Membran identifiziert als Lücke in der basolateralen, Cadherin-positiven  Plasmamembran in frühen Stadien der Neurogenese (E10..5-E11.5) im TIS21-GFP-knock in zeigt, dass der Schritt von Proliferation zu Neurogenese durch einen Wechsel in der Verteilung apikaler Membrankomponenten kontrolliert werden könnte: Apikale Teilungen mit symmetrischer Verteilung der apikalen Membran sind größtenteils proliferierend, Teilungen mit asymmetrischer Verteilung der apikalen Membran Neurone-generierend. Zudem korreliert die Differenzierung mit einer Verlängerung des Zellzyklus: Durch eine kumulative BrdU-Markierung konnte gezeigt werden, dass sich zu Beginn der Neurogenese (E10.5 Telencephalon) der Zellzyklus der Neurone-generierenden Neuroepithelzellen um 40% auf 13 h, gegenüber 9 h in proliferierenden Neuroepithelzellen, verlangsamt. Eine ursächliche Beteiligung von TIS21, das spezifisch in Neurone-generierenden also sich langsamen teilenden Neuroepithelzellen exprimiert ist und bekanntermaßen Zellzyklus-verlangsamend wirkt, an diesem Phänomen ist noch nicht geklärt. Homozygote TIS21-GFP-knock in-Tiere, als TIS21-knock out-Modell, zeigen zumindest keinen  offensichtlichen qualitativ veränderten Ablauf der Neurogenese. Dagegen verschiebt sich im Blutbild das Gleichgewicht von Lymphozyten zu Granulocyten. In Verbindung mit dem in dieser Arbeit beschriebenen embryonalen und adulten Aktivitätsmuster - TIS21 ist in differenzierenden Zellpopulationen verschiedener Gewebe exprimiert - impliziert dies eine allgemeine physiologische Funktion von TIS21 bei Proliferations- und Differenzierungsprozessen. In einer unabhängigen Serie von Experimenten wurde die Möglichkeit untersucht,  durch RNA-interference  (RNAi) spezifisch die Expression von Genen in postimplantorischen Mausembryonen zu unterdrücken. Konkret wurde esi-(endoribonuclease III-prepared short interfering)-RNA (esiRNA) in E10 Mäuseembryonen intraventrikulär injiziert, durch Elektroporation in Neuroepithelzellen transfiziert und der Effekt von RNAi nach 24 h in vitro-Kultur der Embryonen analysiert. esiRNA gegen b-Galaktosidase, koelektroporiert mit einem b-Galaktosidase- und einem GFP-Expressionsvektor, inhibierte spezifisch die b-Galaktosidase- nicht aber die GFP-Expression. In einem analogen Experiment in E10 TIS21-GFP-knock in Embryonen verhinderte die Elektroporation von esiRNA gerichtet gegen GFP die GFP-Expression zu Beginn der Neurogenese – d.h. die Expression eines endogen exprimierten Gens.
date: 2003
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/3373/1/Haubensak.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00003373
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-33739
identifier:   Haubensak, Wulf Eckhard  (2003) Analyse Neurone-generierender Zellteilungen im Neuroepithel der Maus.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/3373/
rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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language: ger