%0 Generic
%A Krewer, Andreas
%C Heidelberg
%D 2025
%F heidok:35680
%R 10.11588/heidok.00035680
%T Charakterisierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors P2Y14 in   Tumor-assoziierten Makrophagen im In-vitro-Modell
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/35680/
%X Makrophagen stellen eine hochgradig heterogene Zellpopulation dar, mit zeitgleich großer Adaptations-  fähigkeit zu den Erfordernissen und Einflüssen der jeweiligen Mikroumgebung. Diese Plastizität von   Makrophagen bedingt die große Anzahl verschiedener Funktionen, die sie als Teil des angeborenen   Immunsystems und als Wächter der Homöostase, Gewebeintegrität und Wundheilung erfüllen müssen.   Angelehnt an die Th1/Th2-Dichotomie, findet eine Einteilung dieser teils sehr unterschiedlichen   Polarisationsformen in der M1/M2-Klassifikation breite Verwendung in der Literatur. Hierbei beschreibt   M1 einen durch Interferon-γ (IFN-γ) induzierten, proinflammatorischen Phänotyp mit Ausrichtung auf   direkte Erregerabwehr und Aktivierung des adaptiven Immunsystems. M2-Makrophagen dagegen   werden typischerweise durch Interleukin-4 (IL-4) induziert und sind durch die Sekretion vorwiegend   immunsuppressiver Moleküle sowie ihre gewebemodellierenden und proangiogenen Eigenschaften   gekennzeichnet. Diese M2- oder M2-ähnlichen Makrophagen spielen insbesondere im Kontext solider   Tumore als Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM) eine große Rolle, da sie mit einer schlechteren   Prognose der überwiegenden Anzahl an Tumorentitäten vergesellschaftet sind. Hierbei fand sich, dass   dies in der vielfältigen direkten oder auch indirekten Förderung von Tumorwachstum, Immunevasion,   Neovaskularisation und Metastasierung durch TAM begründet liegt. Aus diesem Grund ist die   Etablierung neuer Marker zur Erkennung und Beeinflussung dieser Zellen ein vielversprechender   Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Therapiestrategien. Unsere Arbeitsgruppe konnte in früheren   Arbeiten nachweisen, dass eine Stimulation von peripheren CD14+ Blutmonozyten (pBMC) mit   Macrophage colony-stimulating factor (MCSF), Dexamethason und IL-4 für 7 Tage (MDI) in einem M2-  ähnlichen Makrophagen-Phänotyp resultiert und als In-vitro-Modell Anwendung finden kann.   Microarray-Analysen dieser Zellen fanden den purinergen Rezeptor P2Y14 stark hochreguliert. Dieser   Gi-Protein-gekoppelte Rezeptor wird durch Uridin-Diphosphat (UDP) und UDP-Zucker wie UDP-  Glukose aktiviert und wird in vielen Geweben und Zelltypen exprimiert, hierunter auch neutrophile   Granulozyten und Makrophagen. Auch wenn es erste Hinweise gibt, dass P2Y14-Agonisten in   Immunzellen chemotaktische Signale vermitteln, ist dennoch wenig über das Expressionsprofil und die   Funktionsweise von P2Y14 in Makrophagen bekannt. Das Ziel dieser Studie war es daher, die   zugrundeliegenden Faktoren und die funktionelle Relevanz des P2Y14-Rezeptors in M2-ähnlichen   Makrophagen in vitro zu charakterisieren.    Die Charakterisierung erfolgte mittels Polymerase chain reaction (PCR), quantitativer real-time PCR,   Western Blot, Fluorescence activated cell sorting (FACS), Immunhistochemie, Immunzytochemie,   Calcium-Influx-Messungen und Microarrays. Da die getesteten kommerziell erhältlichen Antikörper   gegen P2Y14 unzuverlässige Ergebnisse lieferten, wurde die Herstellung eines eigenen gegen P2Y14-  gerichteten Peptid-Antikörpers in Auftrag gegeben und alle verwendeten Antikörper auf Spezifität   mithilfe einer lentiviral hergestellten, P2Y14+ transgenen U937-Zelllinie getestet.     Die P2Y14-Genexpression findet sich in MDI-stimulierten pBMC im Vergleich zu undifferenzierten   pBMC und ausschließlich mit MCSF-behandelten pBMC deutlich hochreguliert. Diese Hochregulation   der mRNA-Expression zeigt sich ab Tag 3 der Stimulation signifikant und an Tag 5 ihre stärkste   Ausprägung. Diese Arbeit zeigt außerdem, dass die Expressionssteigerung von P2Y14 in MDI-  behandelten Zellen hauptsächlich von Dexamethason vermittelt wird und durch den Glukokortikoid-  Rezeptor-Antagonisten Mifepriston vollständig inhibiert werden kann. Eine ausschließliche Behandlung   mit MCSF und IL-4 ist dagegen nicht ausreichend und kann bei vorgeschalteter Behandlung den   Dexamethason-vermittelten Effekt aufheben. Daneben kann auch die Stimulation mit MCSF +   Lipopolysaccharide (LPS), MCSF + IFN-γ + Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) (MIFT) eine   gesteigerte P2Y14-Genexpression in pBMC auslösen. Eine Hochregulation der P2Y14-Genexpression   durch Dexamethason + IL-4 und IFN-γ + TNF-α findet darüber hinaus auch in mittels Phorbol-12-  myristat-13-acetat (PMA) differenzierten U937 Zellen statt, wobei auch in diesen Zellen die Zugabe von   Mifepriston zu der Stimulation mit Dexamethason + IL-4 geeignet ist, die Expressionssteigerung zu   unterbinden. Die im Rahmen dieser Arbeit generierten FACS-Daten zeigen, dass MDI pBMC eine starke Expression der M2-Marker CD206 und CD163 aufweisen. Diese M2-Marker sind in MIFT-  stimulierten pBMC stark herunterreguliert, dafür weisen diese Zellen eine hohe Expression des   hauptsächlich in M1 exprimierten Major histocompatibility complex II (MHCII) auf. In Vereinbarkeit mit   den mRNA-Expressionsdaten findet sich P2Y14 in beiden Zellpopulationen hochreguliert.   Stimulationen von P2Y14+ transgenen U937 Zellen und pBMC mit UDP-Glukose und dem   synthetischen P2Y14-Agonisten MRS2690 bewirken einen intrazellulären Calcium-Anstieg in diesen   Zellen. Abschließend zeigen die in dieser Arbeit generierten Microarray-Daten von für 24 h mit P2Y14-  Agonisten stimulierten MDI-pBMC eine signifikante Gensatzanreicherung der in Endozytose,   Antigenprozessierung und dem Phosphatidylinositol-3-Kinase/AKT-Signalweg involvierten   Genexpressionen. Die beobachteten Expressionssteigerungen von P2Y14 decken sich hierbei mit den   Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen unter ähnlichen Versuchsumgebungen. Hierbei bietet diese Arbeit   allerdings die erste Beschreibung einer vorwiegend Glukokortikoid-induzierten P2Y14-Expression in   Makrophagen. Angesichts der Limitation der Aussagekraft dieser Studie auf definierte in vitro   Versuchsumgebungen ist eine Erweiterung der Untersuchungen auf die in vivo Situation und die   dazugehörige funktionelle Charakterisierung ein notwendiger nächster Schritt. Zusammengefasst   deuten die Ergebnisse dieser Studie auf eine Relevanz des P2Y14-Rezeptors sowohl für M1- als auch   M2-Makrophagen und eine immunmodulatorische Dimension der dazugehörigen Liganden hin.