TY  - GEN
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurden die für die in vitro Selektion katalytisch aktiver Nukleinsäuren erforderlichen Techniken weiterentwickelt und die Einsetzbarkeit von Ribozymen in der organischen Chemie unter qualitativen und quantitativen Gesichtspunkten evaluiert. Für die in vitro Selektion neuer RNA/DNA-Katalysatoren ist generell die Derivatisierbarkeit von Nukleinsäuren essentiell. Je mehr Möglichkeiten bestehen, in Oligonukleotide funktionelle Gruppen  einzuführen, desto größer ist die mögliche Diversität zu isolierender Katalysatoren. Innerhalb dieser Doktorarbeit konnten generell zwei unterschiedliche Funktionalisierungsansätze erarbeitet werden. Über enzymatische Reaktionen konnten sowohl an terminalen wie auch an molekülinternen Positionen von Nukleinsäuren Funktionalitäten eingefügt werden. Die Synthese zweier Initiatornukleotide zum terminalen Einbau einer Thiol- bzw. Amino-Funktionalisierung in Ribonukleinsäuren ist ein Ergebnis dieser Arbeit. Die jeweilige Struktur der Initiatornukleotide konnte mittels MALDI-MS gesichert, ihr Einbau durch T7-RNA-Polymerase in Oligonukleotide per Autoradiographie von Polyacrylamidgelen gezeigt und durch anschließende Umsetzung mit Biotinmaleimid (Initiator-SH-nukleotid) bzw. Sulfo-NHS-Biotin (Initiator-NH2-nukleotid) ihre  Derivatisierbarkeit bewiesen werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die molekülinterne Funktionalisierung von Desoxyribonukleinsäuren durch Verwendung einer sequenzspezifischen Methyltransferase (M.TaqI) und eines biotinylierten Cofaktoranalogons  möglich ist. Die intern funktionalisierte DNA konnte mittels PCR amplifiziert werden. Dadurch wurde die Kompatibilität mit einem aufgestellten Selektionsschema bewiesen. Die Bildung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen wird als essentieller Bestandteil im Metabolismus einer hypothetischen RNA-Welt angesehen. Künstliche RNA-Katalysatoren wie das in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Diels-Alderase-Ribozym können diese These stützen und darüber hinaus Ausgangspunkt für den Einsatz in vitro selektierter Biokatalysatoren in der Wirkstoffsynthese darstellen. Die praktische Verwendung solcher maßgeschneiderter Ribozyme in der Synthese hängt von den Produktionskosten, Stabilität und Effektivität des Katalysators ab. In Hinblick auf die zukünftige Wirtschaftlichkeit ribozymkatalysierter Reaktionen wurde hier partiell die Technologiebasis für einen Ribozymreaktor geschaffen. Das 49-mer-Minimalmotiv des Diels-Alderase Ribozyms wurde nahezu quantitativ kovalent an einer Festphase immobilisiert. Die katalytische Aktivität und Selektivität blieben dabei erhalten. Die aktivierte Festphase wies eine sehr gute Langzeit-Stabilität auf. Dadurch wurden wesentliche Kriterien bezüglich der Konstruktion eines Ribozymreaktors zur ökonomischen Synthese erfüllt. Zur Umsetzung dieser Idee muss die Effektivität des immobilisierten Ribozyms gesteigert werden. Um dieses Ziel zu erreichen wurden neue, effektivere Diels-Alderasen generiert und charakterisiert. Dabei wurden katalytische RNAs aus einer angereicherten, kombinatorischen RNA-Bibliothek mit Hilfe der in vitro Selektionstechnik durch Einsatz einer Quenched-Flow-Apparatur isoliert. Der Selektionsdruck wurde durch das Herabsenken der Reaktionszeit bis in den Millisekundenbereich erhöht. Nach 17 Selektionsrunden wurde die Selektion beendet. 19 Diels-Alderase-Ribozyme konnten nach Klonierung und Sequenzierung mittels fluoreszenzspektromtetrischen Assays kinetisch charakterisiert werden. Demnach beschleunigen die aktivsten Sequenzen die Reaktion zwischen Anthracen-Konjugat und Biotinmaleimid um das ca. 72000fache und weisen eine apparente Geschwindigkeitskonstante von ca. 940 M-1s-1 auf. Die aktivsten Sequenzen der Selektion beschleunigen die Diels-Alder-Reaktion 3.5 mal besser als das bislang immobilisierten 49-mer des Diels-Alderase-Ribozyms in vergleichbaren Studien.
TI  - Funktionalisierte Nukleinsäuren : Studien & Selektion von Ribozymen
A1  - Schlatterer, Jörg Christian
KW  - in vitro Selektion 
KW  -  Initiatornukleotidein vitro selection 
KW  -  initiator nucleotides
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/3735/
Y1  - 2003///
ID  - heidok3735
AV  - public
ER  -