%0 Generic
%A Lachmann, Sylvie
%D 2003
%F heidok:3756
%K autonomes Parvovirus , Nichtstrukturprotein NS1 , ZytoskelettMinute Virus of Mice , NS1 , replication , phosphorylation , PKC
%R 10.11588/heidok.00003756
%T Funktionelle Bedeutung der Protein-Kinase C eta im Infektionszyklus des autonomen Parvovirus Minute Virus of Mice
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/3756/
%X Das multifunktionale große Nichtstruktur Protein NS1 des autonomem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) wird posttranslational modifiziert und zumindest teilweise über Phosphorylierung reguliert. Aufgrund seiner enzymatischen Funktionen, wie die ATPase-, Helikase- und Nickase-Aktivitäten ist NS1 essentiell für die Initiierung der viralen Replikation. NS1 ist außerdem in der Lage, heterologe Promotoren zu transregulieren und wirkt zytotoxisch auf die Wirtszelle. Die atypische PKClambda -Isoform phosphoryliert und aktiviert NS1 für Helikase-Funktionen. Diese Aktivierung allein ist jedoch nicht ausreichend, um das virale Protein für die rollende Haarnadelreplikation (rolling circle replication) in vitro zu stimulieren.  In der vorliegenden Arbeit konnte eine weitere zelluläre Kinase, PKCeta, identifiziert werden, die NS1 in vitro phosphoryliert und so das virale Polypeptid zusammen mit PKClambda   für die rolling circle Replikation stimuliert. Diese Funktion von PKCeta wurde mittels in vivo Analysen bestätigt. Dazu wurde die permissive Maus-Fibroblastenzellinie, A9, stabil mit Flag-Epitop markierten Mutanten transfiziert, die die endogene PKCeta -Aktivität modulieren. Es resultierten A9 Derivat-Zellinien mit konstitutiv aktiver oder Kinase-inaktiver PKCeta. Eine tryptische Phosphopeptid-Analyse von 32P-markiertem NS1 ergab, daß in Gegenwart einer dominant negativen PKCeta-Mutante distinkte Phosphorylierungsereignisse ausblieben. Diese Beobachtung korrelierte mit einer defizienten Synthese an viralen DNA-Replikationsintermediaten der Gesamtzellpopulation im Southern Blotting sowie auf Einzelzellebene mittels BrdU-Inkorporation. Die Ergebnisse belegen damit die Bedeutung der PKCeta -Phosphorylierungen von NS1 für die Stimulierung der parvoviralen Replikation.  Interessanterweise löst die MVM-Infektion eine Akkumulierung endogener PKCeta in der nukleären Peripherie aus, was als Zeichen der intrazellulären Aktivierung interpretiert wird. Folgerichtig konnte durch Expression einer Kinase-inaktiven Mutante der PKC-aktivierenden upstream-Kinase PDK-1 diese Translokation von endogener PKCeta nach MVM-Infektion unterbunden werden. Außerdem konnte mittels Fraktionierung gezeigt werden, daß ein Zusammenhang zwischen der PKCeta -Aktivität und der Verteilung der Ezrin Radixin Moesin (ERM) -Proteine in vivo besteht, die mit PKCeta  aus einem NS1-aktivierenden zellulären Extrakt über mehrere chromatographische Schritte zusammen aufgereinigt worden waren. Darüberhinaus kolokalisierte Radixin in Immunfluoreszenzanalysen mit den PKCeta-Vollänge-Mutanten an der Plasmamembran. Daraus wurde geschlossen, daß die ERM-Proteine eine Rolle beim Transport von PKCeta zur Plasmamembran spielen könnten. Durch Immunpräzipitation wurde eine spezifische Interaktion zwischen Radixin und der Kinase-inaktiven PKCeta T512A gezeigt, deren funktionelle Relevanz jedoch noch nicht geklärt ist.  Da die beobachtete Aktivierung von PKCeta zu Zeitpunkten auftritt, an denen die virale Replikation bereits weit fortgeschritten ist, liegt die Vermutung nahe, daß die Kinase hier möglicherweise weitere, für den viralen Vermehrungszyklus vorteilhafte, Funktionen erfüllt. Es wurde angenommen, daß MVM dieselben Kinase-Aktivitäten, die es zur Initiierung der viralen DNA-Replikation benötigt, auch für die Virus-induzierten morphologischen- und Zytoskelettveränderungen der Wirtszelle ausnutzen könnte. Aus diesem Grund wurden die nach Infektion auftretenden Zytoskelettalterationen anhand von Markerproteinen in der murinen Wirtszelle A9 sowie den Derivaten mit modulierter PKCeta-Aktivität untersucht und miteinander verglichen. So konnten die beobachteten Strukturveränderungen der Wirtszelle erstmals konkret auf Modifikationen der Mikrofilamente sowie Intermediärfilamente zurückgeführt werden. Eine Rolle für PKCeta  in diesen Abbau- und Deassemblierungs-vorgängen konnte allerdings nicht gezeigt werden.