title: Rekombinante Expression und vergleichende biochemische Charakterisierung der Isoformen C beta1 und C beta2 der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase
creator: Gesellchen, Frank
subject: 570
subject: 570 Life sciences
description: Die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) ist das Schlüsselenzym der cAMP-Signalübertragung. Im Ruhezustand bilden die Isoformen der regulatorischen (R) und katalytischen Untereinheiten (C) Heterotetramere, cAMP setzt daraus die aktiven C-Untereinheiten frei. Unser Wissen über die Funktion der C-Untereinheiten basiert fast ausschließlich auf Daten, die an C alpha erhoben wurden. Über die biochemischen Eigenschaften und die biologische Rolle der C beta-Isoform und ihrer Spleißvarianten ist nur sehr wenig bekannt. Völlig unklar ist bislang, ob und wie die C beta-Untereinheiten zur Weichenstellung in der cAMP-Signalkette beitragen können. Die Spleißvariante C beta2 unterscheidet sich von C beta1 im Exon 1 und ist mit 46 kDa die größte C-Untereinheit in Säugern. In dieser Arbeit konnte mit der Expression in Sf9-Zellen erstmals ein System etabliert werden, das es erlaubt, das  C beta2-Protein katalytisch aktiv zu gewinnen und homogen zu reinigen. C beta2 wurde biochemisch mit den C alpha- und C beta1-Untereinheiten vergleichend charakterisiert. Dabei konnte bestätigt werden, dass C beta2 wesentliche Eigenschaften einer katalytischen Untereinheit der PKA aufweist. Allerdings unterscheiden sich die drei Isoformen signifikant in ihren katalytischen Konstanten - ein möglicher Ansatzpunkte für eine isoformabhängige Feinregulation der Signalweitergabe. Interaktionsanalysen mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) zeigten erstmals, dass C beta1 und C beta2 mit allen Isoformen der R-Untereinheit assoziieren können. Verglichen mit C alpha weisen aber sowohl C beta1 als auch C beta2 verringerte Dissoziationsraten von den Untereinheiten RI alpha und RII alpha auf – dies könnte Konsequenzen für die Regulation der verschiedenen Isoformen in der Zelle haben. Weiterhin scheinen C alpha und C beta unterschiedliche Substrate zu bevorzugen. Während einige Substrate, wie z.B. CREB, unterschiedslos durch alle drei Isoformen phosphoryliert wurden, zeigte sich, dass das basische Myelinprotein und Histon H3 durch C beta1 und C beta2 deutlich geringer phosphoryliert werden als durch C alpha. Darüber hinaus konnte in Histonpräparationen eine inhibitorische Aktivität charakterisiert werden, die nur gegen C beta1 und C beta2, nicht aber gegen C alpha gerichtet ist. Sie weist Eigenschaften eines Proteins auf. Die Entdeckung eines solchen isoformspezifischen Inhibitors könnte der Schlüssel zu einem neuen Verständnis der spezifischen Signalweiterleitung sein. Es bleibt weiteren Arbeiten vorbehalten, zu klären, wie diese Regulation im zellulären Kontext stattfindet und weitere beteiligte Komponenten zu identifizieren. Zusammen mit der isoformspezifischen inhibitorischen Aktivität weisen die beobachtete Substratselektivität und die potentiell frühere Aktivierbarkeit und Abschaltung von C beta-Untereinheiten schon jetzt auf komplexe und vielfältige Möglichkeiten der Zelle hin, mit Hilfe der C beta Isoformen cAMP-Signale selektiv zu verarbeiten.
date: 2003
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/4193/1/Dissertation_Frank_Gesellchen.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00004193
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-41934
identifier:   Gesellchen, Frank  (2003) Rekombinante Expression und vergleichende biochemische Charakterisierung der Isoformen C beta1 und C beta2 der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/4193/
rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
rights: http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/help/license_urhg.html
language: ger