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datestamp: 2004-01-23 10:30:49
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status_changed: 2012-08-14 15:10:43
type: doctoralThesis
metadata_visibility: show
creators_name: Anderl, Jan
title: Synthese und Cytotoxizität membranpermeabler Phallotoxine
title_en: Synthesis and Cytotoxicity of membrane-permeable Phallotoxins
ispublished: pub
subjects: 570
divisions: 140001
adv_faculty: af-14
keywords: Amanita , Permeabilitätphalloidin , phallotoxin , amanita , actin , permeability
cterms_swd: Phalloidin
cterms_swd: Actin
cterms_swd: F-Actin
cterms_swd: Wulstling
abstract: Die Phallotoxine, eine Familie F-Aktin stabilisierender, giftiger Peptide aus dem Grünen Knollenblätterpilz (Amanita phalloides), lassen sich aufgrund ihrer schlechten Membran-permeabilität nur bedingt zur Untersuchung lebender Zellen verwenden. Wie diese Arbeit zeigt, können jedoch durch Kopplung an verschiedene Liganden Phallotoxin-Derivate mit hoher Membranpermeabilität erhalten werden. Insbesondere drei Strategien verbesserten die Translokation der Toxinderivate in  das Zellinnere ohne Verlust der biologischen Aktivität: (1) Die Erhöhung der Hydrophobizität der Toxine durch Veresterung mit Fettsäuren; (2) die Bindung von kationischen Polymeren wie Polylysin; und (3) die Kopplung an trojanische Peptide, wie HIV-Tat-Peptid oder Arginin8, über Disulfid-haltige Linker. Alle drei Strategien lieferten Phallotoxin-Derivate mit Cytotoxizitäten, die bis zu 1000-mal höher waren als die des natürlichen Phalloidins. Die Cytotoxizität wurde anhand der Proliferationshemmung in Mausfibroblasten-Kulturen bestimmt, wobei für Oleoyl-Phalloidin, Tat-SS-Phalloidin und Poly-L-Lysin-Phalloidin IC50-Konzentrationen von 2.5 µM, 3.8 µM bzw. 3.1 µM erhalten wurden (Phalloidin >1000 µM). Da die Affinität von Oleoyl-Phalloidin und Tat-SS-Phalloidin für F-Aktin gering ist (bis zu 40-mal geringer als Phalloidin), kann man von einer hydrolytischen Abspaltung des Toxins durch zelluläre Esterasen im Oleoyl-Phalloidin, bzw. einer Reduktion der Disulfidbrücke im Tat-SS-Phalloidin ausgehen. Fluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen zeigten, daß die Aufnahme bei allen Derivaten über eine nicht-spezifische, adsorptive Endocytose erfolgt. Dabei wurden die modifizierten Phallotoxine an die Zellmembran gebunden, entweder über hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen, anschließend in Vesikeln internalisiert und gespalten, und schließlich über einen unbekannten Transportweg ins Cytosol transportiert. Es stellte sich heraus, daß die vieldiskutierte, permeationsvermittelnde Wirkung der sogenannten trojanischen Peptide weitgehend auf deren kationischer Natur, d.h. auf elektrostatischer Wechselwirkung mit der Membran, beruht. Morphologisch führte die Vergiftung durch membrangängige Phallotoxine zu charakteristischen Veränderungen der Cytoskelett-Struktur der Fibroblasten, wie einer Kumulation des Aktins in "Patches", einer starken Verkleinerung der Zellen und zu häufiger Doppelkernigkeit. Der Nachweis charakteristischer Apoptose-Marker in Jurkat-Zellen deutet darauf hin, daß die toxinbedingte Stabilsierung des Aktin-Cytoskeletts zur Apoptose führt.  Eine therapeutische Verwendung F-Aktin-stabilisierender Toxine zur Proliferationhemmung schien aufgrund der Erfolge Tubulin-stabilisierender Toxine in der Tumorbehandlung interessant. Eine gezielte Vergiftung von Tumor-Zellinien durch Kopplung spezifischer Liganden wie Folsäure, Polyethylenglykole und Albumin an Phallotoxine konnte jedoch an Zellkulturen nicht gezeigt werden. Gleichwohl erscheinen für Folsäurederivate und Albumin-konjugierte Phallotoxine weitere Studien im Tiermodell vielversprechend.
abstract_translated_text: The inhibition of actin dynamics by phalloidin has been studied in great detail. However, phalloidin has been only rarely employed for studying actin dynamics in living cells because of its poor membrane permeability. The aim of the present study was to produce phalloidin derivatives with high membrane permeability by chemical modification of phalloidin or phallacidin. We found three strategies to increase translocation of phalloidin without diminishing its biological activity: (1) Increase the phalloidin hydrophobicity, e.g. by esterification with fatty acids. (2) Binding of phalloidin to cationic polymers, e.g. poly-L-lysine, which mediates uptake of the toxin by endocytosis. (3) Binding of phalloidin to a trojan peptide, e.g. HIV-Tat-peptide, which has been shown to mediate membrane translocation. All three strategies yielded phalloidin or phallacidin derivatives with cytotoxicities  ca. 1000 times higher than native phalloidin. We determined the inhibition of growth of mouse fibroblasts by phalloidin oleate, Tat-phalloidin, and phalloidin-poly-L-lysine, and found IC50 values of 1.8 µM, 5.0 µM, and 10.0 µM, respectively, compared to the IC50 value of >1000 µM  for native phalloidin. Since phalloidin oleate has only low affinitiy to rabbit actin (about 100 times less than phalloidin) we suggest that phalloidin oleate is hydrolyzed by cellular esterases, generating the free toxin. Phalloidin may be released on the cell surface or, more likely, in endosomes. A light microscopy study with FITC-labeled phalloidin as a model for hydrophobic phalloidin derivatives shows most of the fluorescence in endosomal/lysomal compartments, in addition to the expected staining of stress fibers. A future goal of the present study is to combine the high membrane permeability of phalloidin derivatives with a specificity to distinct cell types, e.g. tumor cells. This approach seems promising since phalloidin may be regarded as the "taxol of microfilaments".
abstract_translated_lang: eng
class_scheme: mesh
class_labels: D12.644.456.735
date: 2003
date_type: published
id_scheme: DOI
id_number: 10.11588/heidok.00004362
ppn_swb: 1643624571
own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-opus-43623
date_accepted: 2003-10-24
advisor: HASH(0x556120a1cb10)
language: ger
bibsort: ANDERLJANSYNTHESEUN2003
full_text_status: public
citation:   Anderl, Jan  (2003) Synthese und Cytotoxizität membranpermeabler Phallotoxine.  [Dissertation]     
document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/4362/1/Dissertation.pdf