%0 Generic
%A Toleikis, Lars
%D 2003
%F heidok:4434
%K rekombinante Antikörper , MUC1 , scFv
%R 10.11588/heidok.00004434
%T Rekombinante Antikörper gegen tumorassoziiertes MUC1
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/4434/
%X In Adenokarzinomen wie dem Mammakarzinom wird das tumorassoziierte Antigen MUC1 überexprimiert, dessen extrazelluläre Domäne zum größten Teil aus einem als VNTR (variable number of tandem repeats)-Region bezeichneten Abschnitt besteht. Aufgrund einer im Vergleich zu normalem MUC1 veränderten, weniger starken Glykosylierung der VNTR-Region entstehen in tumorassoziiertem MUC1 neue antigene Determinanten auf Basis der Peptidsequenz und der veränderten Glykosylierung. Im Rahmen dieser Arbeit sollten aus dem Blut von Mammakarzinom-Patientinnen, die wiederholt mit einem synthetischen MUC1-Glykopeptid der VNTR-Region immunisiert worden waren, rekombinante single chain Fv-Antikörperfragmente (scFv-Fragmente) mit spezifischer Bindung an die VNTR-Region von tumorassoziiertem MUC1 gewonnen werden. Ausgehend von cDNA, die aus den peripheren Lymphozyten von mit einem synthetischen MUC1-Glykopeptid immunisierten Mammakarzinom-Patientinnen gewonnen wurde, konnten mittels PCR die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene amplifiziert werden. Durch Klonierung der VH- und VL-Gene in das Phagemid pSEX81 wurden rekombinante scFv-Antikörpergenbibliotheken hergestellt, die anschließend für eine in vitro-Selektion mit Hilfe des Phagendisplays eingesetzt wurden. Aus einer der generierten Antikörpergenbibliotheken konnte durch ein kombinatorisches Panning auf tumorassoziiertem MUC1 sowie synthetischem MUC1-Glykopeptid der VNTR-Region ein Antikörperklon mit der gewünschten Spezifität isoliert werden. Die für das isolierte Antikörperfragment kodierenden Gene wurden in den Vektor pOPE101 kloniert, um ein lösliches rekombinantes scFv-Fragment im periplasmatischen Raum von E. coli zu exprimieren. Das so produzierte scFv-Fragment IIB6 wurde nach erfolgreicher affinitätschromatographischer Reinigung aus periplasmatischen Extrakten bezüglich seiner Spezifität und Affinität analysiert. In ELISA-Bindungsstudien sowie einem Immunoblot wurde die spezifische Bindung des scFv-Fragments IIB6 an die VNTR-Region von tumorassoziiertem MUC1 belegt, wobei das minimale Epitop des Antikörperfragments die Aminosäuresequenz TRPAP besitzt. Außerdem wurde mit Hilfe einer FACS-Analyse gezeigt, dass das Antikörperfragment IIB6 spezifisch an natives, von Zellen der Mammakarzinom-Zelllinie T47D präsentiertes MUC1 bindet. Die mit Hilfe der Oberflächen-Plasmon-Resonanz ermittelten Affinitäten des generierten scFv-Fragments zu tumorassoziiertem MUC1 und synthetischem MUC1-Glykopeptid betragen 2,75 x 10-7 M bzw. 2,28 x 10-7 M. Das generierte scFv-Fragment IIB6 stellt damit ein potentiell geeignetes Ausgangsprodukt für die Herstellung eines vollständig humanen IgG-Antikörpers oder von Antikörperfusionsproteinen zur Behandlung des Mammakarzinoms sowie anderer MUC1-überexprimierender Adenokarzinome dar.