title: Untersuchungen zur Lokalisation und Zugänglichkeit der N-Termini der Strukturproteine VP1 und VP2 im Kapsid des Adeno-assoziierten Virus Typ 2
creator: Kronenberg, Stephanie
subject: 570
subject: 570 Life sciences
description: Bei dem Adeno-assoziierten Virus Typ 2 (AAV-2) handelt es sich um ein Parvovirus, das aufgrund seiner für den Menschen apathogenen Eigenschaften als Vektor für die Gentherapie genutzt wird. Das AAV-2 Kapsid wird von den drei Strukturproteinen VP1, VP2 und VP3 gebildet. Diese weisen ein Molekulargewicht von 87 kDa, 72 kDa und 62 kDa auf und besitzen überlappende Aminosäuresequenzen, die sich nur am N-terminalen Ende unterscheiden. Im N-Terminus von VP1 befindet sich eine Phospholipase A-Domäne, die bei der Infektion von AAV eine Rolle spielt. VP1, VP2 und VP3 liegen im Kapsid, das aus 60 Untereinheiten besteht, mit einer Stöchiometrie von 1:1:8 vor und besetzen symmetrisch äquivalente Positionen. In dieser Arbeit wurde das AAV-2 Kapsid auf struktureller Ebene untersucht. Dazu wurden leere AAV-2 Kapside mittels rekombinanter Adenoviren produziert und mit Hilfe von elektronenkryomikroskopischen Untersuchungen und dreidimensionaler Bildrekonstruktion analysiert. Die resultierende Rekonstruktion mit einer Auflösung von 10,5 Å weist charakteristische Erhebungen an den 3-fachen Symmetrieachsen, leere Kanäle an den 5-fachen Symmetrieachsen und globuläre Strukturen an den 2- fachen Symmetrieachsen auf. Diese Globuli wurden als mögliche Positionen für die bisher, auch in der später erschienenen Röntgenstruktur von AAV-2, nicht lokalisierten N-terminalen Bereiche von VP1 und VP2 identifiziert. Zur Überprüfung der Hypothese, dass es sich bei den globulären Strukturen um die N-Termini handelt, wurden VP1- bzw. VP2-Deletionsmutanten hergestellt. Den mutanten Kapsiden fehlen die globulären Strukturen an den 2-fachen Symmetrieachsen. Dafür treten innen an den Kanälen der 5-fachen Symmetrieachsen zusätzliche Proteindichten auf. Die Zugänglichkeit der N-Termini von VP1 bzw. VP2 auf der Kapsidoberfläche wurde mit zwei monoklonalen Antikörpern analysiert, die ihre Epitope im N-terminalen Bereich von VP1 bzw. VP1 und VP2 haben. Während leere wt AAVKapside und Kapside ohne VP1 keine Reaktion zeigten, war eine deutliche Reaktion bei den Kapsiden ohne VP2 sichtbar. Also muss in VP2 deletierten Kapsiden der NTerminus von VP1 von außen zugänglich sein. Bei DNA-haltigen wt Kapsiden liegen, wie bei den leeren, globuläre Strukturen an den 2-fachen Symmetrieachsen vor. Jedoch zeigen sie eine leichte Reaktion mit den N-terminalen Antikörpern. Um herauszufinden, unter welchen Bedingungen die N-Termini von VP1 auf dem wt AAV-Kapsid zugänglich werden, wurden die Kapside bei unterschiedlichen Temperaturen und abnehmenden pH-Werten inkubiert. Die biochemischen Analysen zeigen, dass die N-Termini von DNA-haltigen, jedoch nicht von leeren wt AAV-Kapsiden nach Inkubation bei 65°C und bei pH 4,5 zugänglich werden. Außerdem ist der Abbau der enkapsidierten DNA nach Behandlung bei 65°C und bei pH 4,5 durch DNase I möglich. Ob dies durch eine Konformationsänderung oder eine partielle Dissoziation der Kapside zustande kommt, kann nicht eindeutig unterschieden werden. Strukturelle Untersuchungen der Kapside nach Inkubation bei 65°C deuten jedoch auf eine konformative Veränderung hin, die sich in der Reduktion der Globuli an den 2-fachen Symmetrieachsen bei den DNA-haltigen Kapsiden äußert. Diese Ergebnisse lassen die Annahme zu, dass unter gewissen Umständen eine Konformationsänderung des Kapsids eintritt, durch die die N-terminalen Bereiche von VP1 und VP2 auf der Kapsidoberfläche zugänglich werden. Dabei könnte die Phospholipase aktiv werden, wodurch ein erfolgreicher Infektionsprozess mit AAV-2 ermöglicht wird.
date: 2004
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/4439/1/Doktorarbeit_gesamt.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00004439
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-44391
identifier:   Kronenberg, Stephanie  (2004) Untersuchungen zur Lokalisation und Zugänglichkeit der N-Termini der Strukturproteine VP1 und VP2 im Kapsid des Adeno-assoziierten Virus Typ 2.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/4439/
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rights: http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/help/license_urhg.html
language: ger