title: Plasmodium falciparum calciumabhängige Proteinkinase 1 (PfCDPK1): Strukturelle und funktionelle Charakterisierung
creator: Möskes, Christian
subject: ddc-610
subject: 610 Medical sciences Medicine
description: Veränderungen der cytosolischen Konzentration von Ca2+-Ionen spielen eine Schlüsselrolle bei der Signaltransduktion eukaryontischer Zellen. Ein Anstieg der Ca2+-Konzentration kann die Reaktion auf eine Vielzahl von Stimuli sein und ermöglicht es der Zelle sich veränderten Umweltbedingungen anzupassen. So konnte für Plasmodium falciparum, den Erreger der Malaria tropica, gezeigt werden, dass Calcium sowohl bei der Invasion der Erythrocyten als auch für die intraerythrocytäre Entwicklung der Parasiten essentiell ist. Als mögliche Zielproteine und Vermittler der Ca2+-induzierten Signaltransduktion wurden unter anderem calciumabhängige Proteinkinasen (CDPKs) identifiziert.  CDPKs haben in Pflanzen und einigen Spezies der Protozoen, so auch in P. falciparum, eine Schlüsselfunktion bei der Vermittlung calciumabhängiger Phosphorylierungsereignisse inne. Sie sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt und ermöglichen es der Zelle, auf zahlreiche Umwelteinflüsse und Stress zu reagieren. CDPKs sind enge Verwandte der Calcium-Calmodulin-abhängigen Proteinkinasen (CaMPK) tierischer Zellen und Pilze. Sie unterscheiden sich aber von diesen durch die Kombination einer katalytischen Serin/Threonin-Proteinkinasedomäne und einer dem Calmodulin verwandten regulatorischen Ca2+-bindenden Domäne in einem Protein. In P. falciparum konnten bisher fünf dem klassischen Typus zuzuordnende CDPKs identifiziert werden. Die P. falciparum calciumabhängige Proteinkinase 1 (PfCDPK1) scheint an der Invasion von Erythrocyten sowie an der Regulation von Membranbiogeneseprozessen beteiligt zu sein.  Die herausragende Bedeutung der CDPKs für die Funktion der Zelle und die Tatsache, dass sie nur in Pflanzen und einigen Protozoen wie Plasmodium, nicht aber in tierischen Zellen vorkommen, macht PfCDPK1 zu einem idealen Angriffsziel für die Entwicklung neuer Pharmaka gegen die Malaria tropica, die den Erreger spezifisch bekämpfen, den menschlichen Wirt dabei aber nicht schädigen. Ein Hauptaugenmerk dieser Arbeit richtete sich deshalb auf die Identifizierung eines spezifischen Inhibitors von PfCDPK1, der als Grundlage für die Entwicklung einer neuen pharmakophoren Leitstruktur dienen sollte. Dabei wurden zwei unterschiedliche Wege eingeschlagen. Zum einen wurden in einem High Throughput Screening sowie in eigenen Laborversuchen mehrere Substanzbanken auf mögliche Inhibitoren von PfCDPK1 untersucht. Zum anderen sollte durch die Kristallisation und anschließende Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von PfCDPK1 und der Bindungsverhältnisse im Molekül die Grundlage für ein molecular modelling eines spezifischen Inhibitors gelegt werden.  Die Kristallisation von Proteinen stellt hohe Anforderungen an die Reinheit und Homogenität eines Proteins in Lösung. Aus diesem Grunde wurde zunächst eine umfangreiche biochemische Charakterisierung von PfCDPK1 durchgeführt, auf deren Grundlage ein Protokoll für die Expression und Aufreinigung geeigneter Expressionskonstrukte von PfCDPK1 entwickelt wurde. Rekombinantes Protein, das nach diesem Protokoll aufgereinigt war, bildete die Ausgangsbasis für zahlreiche Kristallisationsansätze.  Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit befasste sich mit den Membranverankerungs- und Zielgebungsmotiven von PfCDPK1. Die Kinase besitzt in ihrem N-Terminus drei Motive, über die eine Membrananheftung erfolgen kann: eine Konsensussequenz für eine Myristylierung, eine mögliche Palmitylierungsstelle und ein Cluster basischer Aminosäuren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl endogene als auch in vitro translatierte PfCDPK1 myristyliert wird. Darüber hinaus konnte in Membranbindungsstudien mit in vitro translatierter PfCDPK1 bzw. Mutanten mit veränderten Membranankermotiven die Membranbindungsfunktion der Myristylierung und des basischen Aminosäureclusters experimentell bestätigt werden. Die fraktionierte Saponinlyse transient transfizierter Parasiten, welche PfCDPK1 oder eine ihrer Mutanten exprimierten, untermauern diese Beobachtungen. Schließlich sollte mit Hilfe von GFP-Fusionsproteinen der Einfluss der Membranankermotive auf die Lokalisation von PfCDPK1 im infizierten Erythrocyten untersucht werden. Hierzu wurde die N-terminale Signalsequenz von PfCDPK1 und ihrer Mutanten an GFP gekoppelt, die Konstrukte in P. falciparum transfiziert und die Lokalisation der GFP-Konstrukte mittels konfokaler Laser–Scan-Mikroskopie untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass für den Transport der Kinase in die parasitophore Vakuole und von ihr abgeleiteten Membransysteme alle drei Membranbindungsmotive erforderlich sind.
date: 2004
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/4810/1/Dissertation_Christian_Moeskes.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00004810
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-48108
identifier:   Möskes, Christian  (2004) Plasmodium falciparum calciumabhängige Proteinkinase 1 (PfCDPK1): Strukturelle und funktionelle Charakterisierung.  [Dissertation]     
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language: ger