title: Identifizierung und Charakterisierung einer tumorentitätspezifisch überexprimierten Protein-Isoform eines bisher unbekannten Gens
creator: Wasser, Birgit
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: Die Progression von benignen Neoplasien zu malignen Tumoren wird von spezifischen Veränderungen des Genexpressionsmusters begleitet. Die Analyse der differentiellen Genexpression kann daher der Aufklärung der molekularen Mechanismen in der Pathogenese eines Tumors dienen. Zudem können tumorspezifisch überexprimierte Gene in der Krebsdiagnostik eine Anwendung als molekulare Marker finden, indem sie karzinogene Zellen nachweisen.  In der vorliegenden Arbeit wurden zwei alternative Methoden, die Hybridisierung von Protein-Arrays und die in-silico-Analyse von EST-Datenbanken, eingesetzt, mit denen es möglich war potentiell tumorassoziierte Kandidaten-Gene zu identifizieren. Sechs der gefundenen Kandidaten-Gene konnten durch die Anwendung der Real-Time-PCR-Technik als differentiell regulierte Gene im Kolon- oder Lungenkarzinom nachgewiesen werden. Bis auf ein identifiziertes überexprimiertes Gen (GRPR), sind für die Gene bisher weder eine Funktion noch eine differentielle Expression detektiert worden. Aufgrund der signifikanten Überexpression in Lungen-Adenokarzinomen wurde das unbekannte Gen EST 5364 für eine nähere Charakterisierung ausgewählt und mit LUMA (Lung Marker) benannt. Die vorliegende Arbeit charakterisiert das Gen LUMA auf molekularbiologischer und die Genprodukte auf Protein-Ebene.  Die vollständige Länge des LUMA-Transkriptes konnte durch eine „full-length“-Klonierung isoliert werden und korrelierte mit der in einer Northern Blot Analyse detektierten Transkript-Größe. Anhand von Sequenzierungen konnte eine komplexe Vielfalt von alternativen LUMA-Spleiß-Varianten identifiziert werden, die zu drei verschiedenen Carboxy-terminalen Protein-Isoformen führen. Zu LUMA orthologe, bisher unbekannte Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen wurden in verschiedenen Organismen identifiziert und weisen auf eine evolutionäre Konservierung und funktionelle Bedeutung des bisher unbekannten Gens hin. Da keine paralogen Gene ermittelt werden konnten, bestehen derzeit keine Hinweise auf die Zugehörigkeit von LUMA zu einer humanen Genfamilie.  Eine computerbasierende Analyse der LUMA-Protein-Isoformen ergab, dass es sich wahrscheinlich um lösliche Proteine handelt, die zudem Coiled-Coil-Strukturen aufweisen. Die hydrophobe Aminosäureverteilung im C-Terminus einer Spleiß-Variante (LUMA-16A), die durch alternatives Spleißen generiert wird, könnte eine potentielle Transmembran-Domäne darstellen.  Mit generierten polyklonalen und monoklonalen Antikörpern konnte nachgewiesen werden, dass das transkribierte Gen auch translatiert wird und, dass das LUMA-Protein im Zytoplasma lokalisiert ist.  Eine detaillierte RNA-Expressionsstudie an verschiedenen Normalgeweben, Tumor-Zelllinien und Paaren von Lungen Tumor- und Normalgeweben, konnte belegen, dass bestimmte Spleißvarianten sich in ihren Expressionsmustern unterscheiden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass zwei Spleiß-Varianten (LUMA-15A, LUMA-15B), die sich durch Sequenzunterschiede im Exon 15 auszeichnen, tumorspezifisch überexprimiert werden. Eine weitere Spleiß-Variante des Exons 15 (LUMA-D15) zeigte hingegen ein ubiquitäres Expressionmuster in benignen und karzinogenen Zellen. Die Resultate deuten darauf hin, dass die alternative Prozessierung des Exons 15, von dem drei verschiedenen Formen detektiert wurden, eine zentrale Rolle bei der tumorspezifischen Genexpression von LUMA spielt. In immunhistochemischen Analysen an Lungengeweben konnten die auf RNA-Ebene detektierten Expressionsprofile der Spleiß-Varianten auch für die entsprechenden Protein-Isoformen auf Protein-Ebene bestätigt werden. Durch umfassende immunhistochemische Analysen an Lungengeweben wurde nachgewiesen, dass die Protein-Isoform LUMA-15A in sämtlichen analysierten Lungenkarzinom-Subtypen, von NSCL über SCLC, sowie in Lungemetastasen anderer Tumorentitäten meist stark exprimiert wird. Demgegenüber zeigten Lungen-Normalgewebe und Gewebeproben von nicht karzinogenen Lungenerkrankungen keine oder geringe LUMA-15A-Expressionen. Die Auswertung dieser Ergebnisse in Hinsicht auf einen potentiellen LUMA-Diagnostik-Marker zeigte, dass Werte von  90,9% für die Sensitivität und 95,3% für die Spezifität erreicht wurden. In immunhistochemischen Analysen konnte zudem eine erhöhte Expression von LUMA-15A in Blasenkarzinomen im Vergleich zu Blasen-Normalgeweben nachgewiesen werden.  Eine LUMA-15-Expression wurde auch auf zytologischer-Ebene in Zellen aus Bronchialsekreten detektiert. Durch eine Doppelfärbung von LUMA-15A und Ki67 war es in Bronchialsekreten von Lungenkarzinom-Patienten (Plattenepithel- und Adenokarzinom) möglich, maligne Zellen spezifisch zu identifizieren. Eine Expression von LUMA-15A als auch von Ki67 wurde lediglich in Tumorzellen nachgewiesen.  Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine potentielle pathogenetische Bedeutung von LUMA-Spleiß-Varianten bzw. Protein-Isoformen im Bronchial- und Blasenkarzinom hin und bieten möglicherweise die Basis für die Entwicklung eines Krebs-Diagnostik-Tests.
date: 2004
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/5322/1/Dissertation.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00005322
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-53225
identifier:   Wasser, Birgit  (2004) Identifizierung und Charakterisierung einer tumorentitätspezifisch überexprimierten Protein-Isoform eines bisher unbekannten Gens.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/5322/
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language: ger