TY - GEN ID - heidok5428 AV - public Y1 - 2004/// KW - Tonoplast intrinsisches Protein KW - TIP KW - MIP KW - ImmunmarkierungTonoplast intrinsic protein KW - TIP KW - MIP KW - Immunolabeling TI - Korrelative licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zu Tonoplast intrinsischen Proteinen als Merkmale verschiedener Vakuolentypen N2 - Die pflanzliche Vakuole ist ein multifunktionales Organell, das von zentraler Bedeutung für die Morphologie und Physiologie der einzelnen Zellen und der gesamten Pflanze ist. Aufgrund des hydrolytischen Milieus in ihrem Innern wird sie häufig mit dem Lysosom tierischer Zellen verglichen. Ihre Funktionen sind jedoch wesentlich vielseitiger. Hinzu kommt, dass in den letzten Jahren gezeigt werden konnte, dass eine pflanzliche Zelle zwei funktionell verschiedene Vakuolen aufweisen kann: die lytische Vakuole und die Proteinspeichervakuole. Eine solche Differenzierung, die zwei alternative sekretorische Wege zu den jeweiligen Vakuolen erfordert, wurde bisher weder für das Lysosom tierischer Zellen noch für die Vakuole der Hefe beschrieben. Die zwei verschiedenen Vakuolentypen pflanzlicher Zellen konnten dabei nicht nur aufgrund ihres Inhalts und dessen pH-Wert unterschieden werden, sondern auch anhand verschiedener Isoformen der in ihren Tonoplasten enthaltenen Aquaporine, den ?tonoplast intrinsic proteins? (TIPs). Dabei wird alpha-TIP im Tonoplast als Merkmal für Proteinspeichervakuolen und gamma-TIP als Merkmal für den Tonoplast lytischer Vakuolen angesehen. Ausgehend von dieser Hypothese wurden die Wurzelspitzen von Keimlingen und zehn Tage alten Gersten- und Erbsenpflanzen zunächst ultrastrukturell und dann durch Immunmarkierungen untersucht. Hierfür wurden intakte Wurzelspitzen verwendet, sodass der Entwicklungsstand der Zellen, und damit ebenfalls ihrer Vakuolen, aufgrund ihrer Lage innerhalb der Wurzeln abgelesen werden konnte. Durch die Immuno-fluoreszenz-Markierungen wurde die generelle Verteilung der jeweiligen Proteine innerhalb der Wurzeln ermittelt, während die Immunogold-Markierung bei wesentlich höherer Auflösung der genauen Lokalisation innerhalb der Zellen diente. Diese korrelative Studie ermöglichte somit eine sehr differenzierte Auswertung bei optimaler Auflösung. Dadurch konnte gezeigt werden, dass in Wurzeln von Gerstenkeimlingen und zehn Tage alten Gerstenpflanzen Gerstenlektin gespeichert wird. Bei den Erbsen hingegen wird nur in den Wurzeln von Keimlingen Vicilin gebildet, während in den Wurzeln der zehn Tage alten Erbsenpflanzen Vicilin nicht mehr nachgewiesen werden kann. Dabei konnte eine generelle Korrelation zwischen dem Vorkommen von dem als Markerprotein für den Tonoplast von Proteinspeichervakuolen angesehenen alpha-TIP und den Speicherproteinen in einem Gewebe bestätigt werden. Innerhalb der Wurzeln stellte sich jedoch heraus, dass die Bereiche, in denen alpha-TIP vorkommt, nicht vollständig übereinstimmen mit den Bereichen, in denen die Speicherproteine nachgewiesen wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine gleichzeitige Immunogold-Markierung von alpha- und gamma-TIP an Schnitten von Gersten- und Erbsenkeimwurzeln angefertigt. Das Ergebnis dieser Markierung ist, dass in den Wurzelspitzen von Gersten- und Erbsenkeimlingen keine Vakuolen identifiziert werden konnten, die ausschließlich gamma-TIP in ihrem Tonoplast enthalten. Dies steht im Widerspruch zu den Ergebnissen von Immunofluoreszenz-Markierungen von Gersten- und Erbsenkeimwurzel-Quetschpäparaten. Diese führten zu der Theorie, dass in den Gersten- und Erbsenkeimwurzeln zunächst zwei unterschiedliche Vakuolen entstehen, die im Zuge der Entwicklung miteinander verschmelzen. Stattdessen deuten die vorliegenden Daten darauf hin, dass die Vakuolen in den meristematischen Keimwurzelzellen durch autophagische Membranstrukturen entstehen, die zunächst ausschließlich alpha-TIP enthalten. Im Zuge der Entwicklung wird zusätzlich zum alpha-TIP auch gamma-TIP in die Tonoplasten der daraus entstehenden Vakuolen integriert. Da in diesen Vakuolen Speicherproteine nachgewiesen werden können, handelt es sich um Proteinspeichervakuolen. Für das als Markerprotein für lytische Vakuolen angesehene Aquaporin gamma-TIP konnte somit überraschenderweise sehr deutlich gezeigt werden, dass es im Tonoplast von Proteinspeichervakuolen vorkommt. Zusätzlich konnte - entgegen den Erwartungen - in den Tonoplasten der Vakuolen des sich ausbildenden Zentralzylinders, die keine Speicherproteine enthalten und somit lytische Vakuolen darstellen sollten, gamma-TIP nicht nachgewiesen werden. Gamma-TIP kann deshalb in den Wurzelspitzen nicht als Markerprotein für den Tonoplast lytischer Vakuolen eingesetzt werden. Die vorliegenden Daten zeigen somit deutlich, dass zumindest in Wurzelgeweben von der Verwendung der TIP-Isoformen als Merkmal zur Identifikation von verschiedenen Vakuolentypen abgesehen werden sollte und stellt generell in Frage, ob Aquaporine als Marker fungieren können. Um neben den Inhaltsstoffen zuverlässige Merkmale für die einzelnen Vakuolentypen zu finden, wäre es deshalb empfehlenswert in Zukunft nach vakuolären Membranproteinen zu suchen, die an Schlüsselfunktionen der sekretorischen Sortierungsmaschinerie beteiligt sind. UR - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/5428/ A1 - Olbrich, Andrea ER -