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TI  - DNS-Sequenzierung durch Einzelmolekülhydrolyse
N2  - Das Ziel der Einzelmolekülexperimente in dieser Arbeit ist, Lösungen auf dem Weg zu einer Einzelmolekül-DNS-Sequenzierung zu finden. Zunächst wird die Frage nach der Ausdehnung des Detektionsvolumens in Relation zur Kapillare mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie beantwortet. Dazu wird eine Theorie der FCS mit einem ellipsoid-gaussförmigen Detektions-volumen unter der Randbedingung zylindrischer, undurchdringbarer Wände abgeleitet. Die entwickelte Modellfunktion wird gemessenen Korrelationskurven angepaßt. Das Ergebnis ist, daß die Detektionsempfindlichkeit am oberen und unteren Kapillarrand auf etwa 68 %, an den seitlichen Kapillarrändern auf 19 % des Maximalwertes abgefallen ist. Bei den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen Cy5 und Mr121 ist es mit der entwickelten Ereigniserkennungssoftware demnach möglich, mehr als 99 % der aus der Kapillare austretenden Moleküle zu erfassen. Dank des niedrigen Untergrundsignals und der Rauschunterdrückung durch geeignete Filter ist die Zählrate falsch-positiver Ereignisse mit 7,9E-19 Hz vernachlässigbar. Es wurde ein Verfahren zur elektrophoretischen Selektion einzelner DNS-Stränge erprobt. Die Sequenzierversuche an Modelloligonucleotiden, statistisch markierten PCR-Produkten und an an zwei Basen vollständig markierter DNS ergab mittlere Schneideraten von E. coli-Exonuclease I am Einzelmolekül von 280 Hz bei 3,6 % Markierungsdichte und 3 Hz bei 50 % Markierungsdichte. Es konnte auf einem 99,75 %-Signifikanzniveau nachgewiesen werden, daß die gemessene Sequenz Information aus der abgebauten Sequenz enthält, die erreichte Leselänge betrug 31 Basen. In der vorliegenden Arbeit konnten wichtige Ergebnisse auf dem Weg zur Einzelmolekülsequenzierung erzielt werden, die Steigerung der Leselänge bleibt aber ein wichtiger Bestandteil zukünftiger Forschung.
ID  - heidok5498
Y1  - 2005///
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/5498/
A1  - Göbel, Florian
ER  -