title: Studium der Konformationsdynamik von Hairpin-Oligonukleotiden durch Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie
creator: Piestert, Oliver
subject: ddc-540
subject: 540 Chemistry and allied sciences
description: Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass FRET und PET zwei komplementäre Techniken zur Verfolgung der Konformationsdynamik von Biopolymeren sind. Es konnten DNA-Hairpins synthetisiert werden und deren Konformationsdynamik zwischen geschlossener und geöffneter Form mit Hilfe der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie direkt verfolgt werden. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten DNA–Hairpins sind einzelsträngige DNA–Sequenzen, die eine Komplementarität an beiden Enden der Sequenz aufweisen. Dadurch kommt es zur intramolekularen Hybridisierung, d.h. es bildet sich eine Stamm/Schleife-Struktur. Die DNA–Hairpins wurden unter unterschiedlichen Bedingungen vermessen, die dazu führen, dass die geöffnete oder geschlossene Konformation stabil ist, oder dass es zu thermisch induzierten Fluktuationen der Konformation kommt. In Gegenwart von Gegensequenz wird der DNA-Hairpin durch Hybridisierung mit der komplementären Sequenz dauerhaft geöffnet. Ziel der Arbeit war die direkte Verfolgung der Konformationsdynamik einzelner DNA– Hairpins im Laserfokus. Spezielles Interesse galt hierbei der Bestimmung der Assoziations- und Dissoziationsraten unter Berücksichtigung des PET als neue Methode zur Bestimmung von konformativen Änderungen. Als Standartmethode zur Bestimmung von konformativen Änderungen wurde FRET verwendet. Bei diesem Hairpin wurden sowohl der Donor-, als auch der Akzeptorfarbstoff an den beiden Enden des Hairpins angebracht, so dass im geschlossenen Zustand eine hohe Energietransfer-Effizienz resultiert. Im geöffneten Zustand ist der Abstand zwischen Donor und Akzeptor so groß, dass nur noch wenig Energie vom Donor auf den Akzeptor transferiert wird. Unter Hochsalzbedingungen ist der Hairpin geschlossen und der Abstand zwischen Donor und Akzeptor ist optimal für einen effektiven Energieübertrag. Erniedrigt man die Salzkonzentration, sieht man immer wieder Wechsel in der FRET-Effizienz der Fluoreszenz – teilweise erhält man hauptsächlich Akzeptorfluoreszenz, die anzeigt, dass der Hairpin geschlossenen ist, andererseits erhält man donordominierte Fluoreszenz, die anzeigt, dass der Hairpin geöffnet ist. Durch Zugabe von Gegensequenz wird der Hairpin dauerhaft geöffnet. Bestimmt man die Zeiten, in denen der DNA-Hairpin offen ist, d.h. kein FRET zwischen dem hier verwendeten Donor Cy3 und Akzeptor Cy5 stattfindet, kann die Kinetik des Prozesses bestimmt und dadurch die Geschwindigkeitskonstante der Öffnung des Hairpins berechnet werden. Für das Schließen des Hairpins konnte hierbei eine Geschwindigkeitskonstante von k = 1,3 ± 0,13 1/s bei 22°C bestimmt werden. Die Öffnungskinetik ist wesentlich langsamer und konnte deshalb nur indirekt bestimmt werden, da diese von der Photozerstörung überlagert ist. Die Geschwindigkeitskonstante der Öffnung des Hairpins wurde deshalb über die Gleichgewichtskonstante aus der Schmelzkurve des Hairpins im Ensemble errechnet. Sie beträgt k* = 10,8 ± 2 1/s. Vergleicht man dies mit der Proteinfaltung, so verlaufen Konformationsänderungen an DNA-Hairpins um einige Größenordnungen langsamer, was mit der Aufgabe der DNA als Informationsspeicher zu dienen und der dafür notwendigen größeren Starrheit erklärbar ist. DNA–Hairpins auf Basis des Photoinduzierten Elektronen Transfer (PET) zeigen ein wesentlich komplexeres Verhalten. Aufgrund der wesentlich stärkeren Abstandsabhängigkeit bei PET als FRET, sieht man kleinste Änderungen der Konformation, wie z.B. Interkalation und Furchenbindung. Dadurch ändert sich der Betrag des Überlappungsintegrals und das Quenchverhalten des Farbstoffes ändert sich. Autokorrelationen der Fluoreszenzintensität zeigen, dass der Farbstoff nur für Millisekunden bis Mikrosekunden einen Komplex mit dem Quencher bildet und dann wieder dissoziiert. Frühere Studien haben diese Fluktuationen als Öffnungs- und Schließungskinetik interpretiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Einblicke in die Funktionsweise von DNA-Hairpin–Farbstoffkonstrukten gewonnen werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die entwickelte Technik ebenso erfolgreich für diagnostische Anwendungen verwendet werden kann. So konnten bestimmte DNA – Sequenzen spezifisch bis zu einer Konzentration von 10-13 M mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie durch Einschränkung der Konformationsdynamik nach erfolgreicher Hybridisierung nachgewiesen werden. Durch die Bestimmung der Konformation (geöffnet oder geschlossen) auf Einzelmolekülebene konnten erstmals bestimmte Zielsequenzen im subpikomolaren Bereich nachgewiesen werden.
date: 2005
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/5663/1/Promotion_Oliver_Piestert.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00005663
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-56635
identifier:   Piestert, Oliver  (2005) Studium der Konformationsdynamik von Hairpin-Oligonukleotiden durch Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie.  [Dissertation]     
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language: ger