title: Entwicklung und Anwendung neuartiger Trägeroberflächen zur kombinatorischen Peptidsynthese mit Aminosäure-Tonerpartikeln
creator: Beyer, Mario
subject: ddc-540
subject: 540 Chemistry and allied sciences
description: Die Steigerung der Komplexität von Peptidbibliotheken bzw. Peptidarrays ist ein wichtiger Schritt bei der Identifizierung von bislang unbekannten Ursachen und Verläufen häufiger Krankheiten. Die bereits erfolgreich vollzogene Weiterentwicklung der etablierten Tintenstrahl-Drucktechnik zu laser- und tonerbasierten Systemen hinsichtlich Druckauflösung und Druckgeschwindigkeit könnte ein möglicher Ansatzpunkt für zukünftige Peptidarrayproduktionen dazu sein. Zu diesem Zweck wurden Aminosäuretoner entwickelt und charakterisiert, die mit einem technisch modifizierten Laserdrucker auf Trägeroberflächen gedruckt und mit ihnen zur Reaktion gebracht werden können. Die Entwicklung geeigneter Trägeroberflächen stand dabei im Mittelpunkt dieser Arbeit. (1.) Oberflächenmodifikationen: Es konnten proteinresistente Glasoberflächen als Trägermaterialien für die kombinatorische Peptidsynthese im Arrayformat mit Hilfe einer UV-induzierten Graftpolymerisation von Poly(ethylenglykol)methacrylat (PEGMA) erzeugt werden. Zuvor werden dazu auf Glasträgern Monoschichten aus 7-Octenyltrichlorosilan hergestellt, auf denen anschließend durch Ozon photosensitive, oberflächengebundene Radikalstarter generiert wurden. Die Ozonisierung der Silanfilme wurde mittels XP- und IR-Spektroskopie sowie Messungen des Kontaktwinkels zeitlich verfolgt. Die Optimierung der Graftfilmdicke geschah durch Variation von Bestrahlungsdauer und Monomerkonzentration und erfolgte durch ellipsometrische Schichtdickenmessungen an Siliziumoberflächen. Die Einführung von Aminogruppen mit einer variablen Funktionalitätsdichte erfolgte über die Veresterung von Carbodiimid-aktiviertem Fmoc-ß-Alanin. Die erzeugten Filme sind gegenüber 91 %iger Trifluoressigsäure (TFA) stabil und darüber hinaus resistent gegenüber unspezifischer Proteinadsorption. Die Verifizierung der Proteinresistenz erfolgte durch Inkubation mit vier verschiedenen Proteinlösungen (Fibrinogen, Lysozym, BSA und g-Globulin) in PBS-Puffer und anschließender Auswertung von N1s-XP-Detailspektren. (2.) Aminosäure-Tonerpartikel: Es konnten mit allen zwanzig voraktivierten, proteinogenen Aminosäuren (Fmoc-L-Aminosäure-Pentafluorphenylester) Tonerpartikel auf der Basis von OKI-Farbtonern synthetisiert und charakterisiert werden, die vergleichbare Größenverteilungen im Bereich von 9 µm und Ladungseigenschaften wie ihre Vorbilder aufweisen. Ihre Fähigkeit zur qualitativen Kopplung an aminoterminierte Glasoberflächen konnte über ein Anfärben der entschützten Aminogruppen nach der Reaktion mit der Oberfläche gezeigt werden. (3.) Peptidsynthesen mit Aminosäuretonern: Drei verschiedene Peptidepitope (DTYRYIDYA, YPYDVPDYA und DYKDDDDK) wurden mit Aminosäuretoner (und zum Vergleich aus einer Lösung in DMF) auf mit Rink-Linker modifizierten, PEG-gegrafteten Glasobjektträgern großflächig synthetisiert. Die Kopplungsausbeuten der einzelnen Syntheseschritte wurden UV-spektroskopisch verfolgt. Nach Abspalten der Peptide vom Träger mit TFA konnten alle drei Sequenzen durch MALDI-TOF-Messungen als Amide identifiziert werden. (4.) Peptidlaserdrucker und Peptidarray: Der entwickelte Peptidlaserdrucker ist in der Lage, innerhalb von ca. 70 Sekunden einen derivatisierten Glasträger (21 cm x 20 cm) mit ca. 155.000 Spots (Ø ca. 250 µm) zu bedrucken. Er basiert auf der Technik der Farblaserdruckerserie C7200 von OKI und besteht aus zwanzig hintereinander angeordneten Tonerkartuschen in einer Rahmenkonstruktion. Der zu bedruckende Träger wird auf einem Schlitten mit präzisem Linearantrieb bewegt. Ein erster Test-Array vor Inbetriebnahme des Druckers, bestehend aus den schachbrettartig angeordneten Epitopen YPYDVPDYA und DYKDDDDK, wurde durch Ausdruck der Aminosäuretoner auf Laserdruckerfolien und anschließenden Transfer auf den Glasträger synthetisiert. Der Nachweis erfolgte durch eine Inkubation des Trägers mit Mischungen aus den spezifischen Erst- und den fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpern und Auswertung mit einem Fluoreszenzscanner.
date: 2005
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/5958/1/Beyer_Mario.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00005958
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-59586
identifier:   Beyer, Mario  (2005) Entwicklung und Anwendung neuartiger Trägeroberflächen zur kombinatorischen Peptidsynthese mit Aminosäure-Tonerpartikeln.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/5958/
rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
rights: http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/help/license_urhg.html
language: ger