TY  - GEN
AV  - public
TI  - Functional analysis of Nt-Hypo1 and NtPLC3, two novel pollen-specific proteins from Nicotiana tabacum
Y1  - 2005///
ID  - heidok5964
KW  - PI-4
KW  - 5-P2tip growth 
KW  -  polar growth 
KW  -  PI-4
KW  - 5-P2 
KW  -  PI-PLC 
KW  -  pollen tubes
A1  - Helling, Diana
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/5964/
N2  - Pollenschläuche stellen ein ideales Modellsystem zur Erforschung der Prozesse dar, die pflanzliches Spitzenwachstum steuern oder regulieren. Pollenschläuche sind longitudinale Zellen, die äußerst schnell und zielgerichtet durch das weibliche Blütengewebe wachsen und der Übertragung männlicher Geschlechtszellen in die Samenanlage und somit der Befruchtung der Eizelle dienen. Um den hochkomplizierten Prozess des polaren Wachstums gewährleisten zu können, müssen in der Zelle zahlreiche Signalübertragungsprozesse in Gang gesetzt, um dem Pollenschlauch seinen Weg zu weisen und ausreichend Zellwand- bzw. Plasmamembranmaterial zur Verfügung zu stellen. Man geht davon aus, dass pflanzliche Homologe der Rho-Familie kleiner GTPasen im Zusammenspiel mit PI-4,5-P2 eine wichtige Aufgabe der Signaltransduktion übernehmen und somit eine ganz entscheidende Rolle in der Regulation des Spitzenwachstums einnehmen.  Die vorliegende Dissertation befasst sich mit zwei voneinander unabhängigen Projekten. Das zu Anfang beschriebene Projekt repräsentiert das Nebenprojekt. Die Intention des Projektes war es, einen pflanzen-spezifischen Guanine-Nukleotid-Exchange-Faktor (GEF) zu identifizieren. Zu Beginn der Dissertation war die Aktivierung der Rac/Rop GTPasen im Pflanzenreich noch nicht geklärt und pflanzen-spezifische Rho GEFs waren bislang nicht identifiziert. In einem zwei-Hybrid-Interaktionsversuch, in dem eine dominant negative Mutante der kleinen GTPase Nt-Rac5 aus Tabak als ?bait? eingesetzt wurde, haben wir ein Protein identifiziert, das 76 Aminosäuren umfasst. Dieses hypothetische Protein interagierte mit Nt-Rac5 in Hefezellen sowie in in vitro pull-down Experimenten. Nt-Hypo1 ist ein pollenspezifisches, lösliches Protein, das im Zytoplasma der Pollenschläuche akkumuliert. Durch RNA-Interferenz wurden transgene Tabak-Pflanzen erzeugt, in denen die Expression des hypothetischen Proteins ausgeschaltet wurde. Diese Pflanzen werden weiterhin in bezug auf Defekte im Pollenschlauchwachstum und der Fertilisation untersucht. Weitere Experimente werden durchgeführt, um die Frage nach der Funktion des hypothetischen Proteins bzw. seine Beteiligung in einem Multi-proteinkomplex mit potentieller GEF-Aktivität zu beantworten. Das Hauptprojekt dieser Dissertation befasst sich mit der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung einer Phosphoinositid-spezifischen Phospholipase C aus Tabak. PI-PLCs sind Ca2+-abhängige Enzyme, die PI-4,5-P2 hydrolysieren und dabei die Botenstoffe Diacylglycerol und Inositol 1,4,5-trisphosphat bilden. DAG verbleibt mit der Membran assoziiert, InsP3 hingegen diffundiert ins Zytoplasma, öffnet möglicherweise Ca2+-Kanäle und erhöht somit die intrazelluläre Ca2+-Konzentration. PI-4,5-P2 spielt eine bedeutende Rolle in der Regulation des polaren Pollenschlauchwachstums und arbeitet dabei zusammen mit Rac/Rop GTPasen. Die Intention dieses Projektes war es, eine Verbindung der PI-PLCs mit Rac/Rop GTPasen, PI-4,5-P2 und der Etablierung eines spitzen-fokussierten Ca2+-Gradienten herstellen, die alle nachweislich an der Regulation des pflanzlichen Spitzenwachstums beteiligt sind.  Wir haben eine neue pollenspezifische PI-PLC Isoform, NtPLC3, aus Tabak durch Kolonie-Hybridisierung isoliert sowie ihre Lokalisierung in Pollenschläuchen durch YFP-Markierung in vivo bestimmt. Überdies haben wir durch die Herstellung einzelner Deletionsmutanten gezeigt, dass zwei Domänen, die EF-Hand, sowie die C2 Domäne, essentiell für die Membranbindung der PI-PLC sind. Die Herstellung von Chimären aus pflanzlichen und tierischen PI-PLC Domänen hat weiterhin gezeigt, dass Regionen im katalytischen Zentrum dafür verantwortlich sind, NtPLC3 von der Membran an der Pollenschlauchspitze fernzuhalten, unabhängig davon, ob das Enzym aktiv ist oder nicht. Weiterhin haben wir gezeigt, dass NtPLC3 Ca2+-abhängig PI-4,5-P2 in vitro hydrolysiert und die Hydrolyse entweder durch einfache Punktmutationen im katalytischen Zentrum oder durch das Aminosteroid U-73122 gehemmt werden kann. Durch den Einsatz der PH-Domäne der tierischen PI-PLC d1, der als Bioindikator für PI-4,5-P2 dient, haben wir die komplementäre Anordnung von PI-4,5-P2 und NtPLC3 in vivo gezeigt.  Basierend auf den beschriebenen Experimenten und der Beobachtung, dass sich PI-4,5-P2 an der Plasmamembran in der Pollenschlauchspitze nach Inhibitor-Zugabe ausbreitet, schließen wir, dass PI-PLCs die lokal begrenzte Verteilung von PI-4,5-P2 kontrollieren. Unsere Daten zeigen, dass PI-PLCs essentiell am pflanzlichen Spitzenwachstum beteiligt sind. Wir schlagen daher vor, dass eine Schlüsselfunktion der PI-PLCs in Pollenschläuchen die räumliche Begrenzung der PI-4,5-P2-Verteilung in der Spitze der Pollenschläuche ist und sie somit gewährleisten, dass Aktin-bindende Proteine sowie Proteine, die Vesikel¬fusionen mit der Plasmamembran begünstigen, lokal an PI-4,5-P2 in der Spitze binden können und auf diese Weise das polare Wachstum gewährleistet wird.
ER  -