title: Entwicklung, Optimierung und Validierung eines Immunoassays zur sensitiven Detektion des endokrinen Disruptors 17alpha-Ethinylestradiol
creator: Schneider, Christian
subject: 540
subject: 540 Chemistry and allied sciences
description: Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Analytik von 17alpha-Ethinylestradiol (EE2) in der aquatischen Umwelt. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag dabei in der Entwicklung und Optimierung von Enyzm-Immunoassays (ELISAs) zur direkten Bestimmung des Analyten im Konzentrationsbereich von 1 - 10 Nanogramm pro Liter.  Es wurden drei neue ELISAs für EE2 entwickelt.  Für den ersten Assay (Bio-LC EE2 ELISA) wurde ein biotinyliertes Ethinylestradiolderivat synthetisiert und im ELISA als Tracer verwendet. Durch Verwendung eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugats und Ausnutzung der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung wurde anschließend Peroxidase an den Biotin-Tracer gebunden.  Im zweiten Assay (EE2 ELISA) wurde ein direktes Enzymkonjugat des EE2 mit Meerrettichperoxidase synthetisiert. Dieses fungierte im EE2 ELISA als Tracer. Die Detektion erfolgte auch hier photometrisch. Im Vergleich zum Bio-LC EE2 ELISA wurde im EE2 ELISA das Protokoll vereinfacht und der Zeitbedarf konnte von 120 auf 70 Minuten reduziert werden.  Der dritte Assay (EE2 CLEIA) leitete sich unmittelbar vom EE2 ELISA ab, es wurde das gleiche Enzymkonjugat verwendet. Zur weiteren Sensitivitätssteigerung wurde die Antikörperverdünnung von 1:50.000 auf 1:200.000 , und die Tracerverdünnung von 1:50.000 auf 1:500.000  erhöht.  Eine typische Messung von 24 Realproben mit dem Chemilumineszenzassay (EE2 CLEIA) dauert nur noch 40 Minuten. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenze (LOD bzw. LOQ), sowie die Messbereiche der drei Assay betragen: Bio-LC EE2 ELISA: LOD 2,6 ng/L / LOQ 21 ng/L / Messbereich 0,025 – 55 µg/L EE2 ELISA: LOD 0,5 ng/L / LOQ 6,0 ng/L / Messbereich 0,004 – 130 µg/L EE2 CLEIA: LOD 0,2 ng/L / LOQ 1,4 ng/L / Messbereich 0,8 –100 ng/L Diese drei Assays gehören damit zu den derzeit vier empfindlichsten Immunoassays für die Bestimmung von EE2. Mit Hilfe des EE2 CLEIA konnten erstmalig direkte Messungen im ökotoxikologisch relevanten sub ppt-Bereich realisiert werden. Neben der Steigerung der Assaysensitivität wurde eine umfassende Studie zur Selektivität und Stabilität der Assays durchgeführt. Zur Untersuchung der Selektivität dienten elf Steroidhormone bzw. Hormonderivate, darunter die häufig in Umweltproben vorliegenden Substanzen Estron und Estradiol. Das EE2-Antiserum zeigte hierbei ein extrem selektives Bindungsverhalten bezüglich EE2. Typische Kreuzreaktivitäten, beispielsweise für Estron und Estradiol, lagen zwischen 0,1 und 0,3 %. Nennenswerte Kreuzreaktivitäten traten lediglich für Konjugate des EE2 an der Ringposition drei auf (Glucuronsäureaddukte: 17-22 % und Sulfate: 34-37 %). Dies steht in Zusammenhang mit der Struktur des für die Immunisierung verwendeten BSA Konjugats des EE2.  Die Matrixstabilität der ELISAs wurde anhand eines kommerziellen Huminsäurepräparates untersucht. Der Bio-LC EE2 ELISA erwies sich als störungsanfällig und nicht stabil bezüglich der verwendeten Huminsäure. Im Gegensatz dazu zeigte der EE2 ELISA und EE2 CLEIA ein robustes Verhalten und ermöglichten auch in Gegenwart erhöhter Huminsäurekonzentrationen die zuverlässige Bestimmung des EE2. Zusätzlich zu Aufbau und Optimierung der ELISAs wurde, ausgehend von bekannten Verfahren, eine SPE-Methode (solid phase extraction) zur Anreicherung und Aufreinigung von Wasserproben modifiziert und weiterentwickelt. Der wesentliche Vorteil der neuen Methode besteht in der geringeren Belastung der Extrakte durch Matrixkomponenten. Dies wurde ermöglicht durch die Verwendung eines neutralen pH-Werts zur Anreichung der Proben und der Einbeziehung spezieller Waschschritte mit organischen Lösungsmitteln zur Entfernung der Huminstoffe. Abschließend wurde die Praxistauglichkeit des EE2 ELISA und EE2 CLEIA im Rahmen einer Feldstudie untersucht und durch den Vergleich zu einem Referenzlabor validiert. Insgesamt wurden acht Proben aus Fließgewässern und zwölf Proben aus Kläranlagenabläufen gemessen. Für die Flussproben ergab sich eine Mediankonzentration von 0,6 ng/L und für die Proben aus Kläranlagenabläufen von 1,3 ng/L. Die Ergebnisse der Referenzmessungen (LC-MS/MS, LOD 1,0 ng/L) führten, bedingt durch die zu hohe Nachweisgrenze, meist zu (falsch-)negativen Befunden. Durch die vorliegende Arbeit konnte die Nachweisgrenze zur direkten Bestimmung von EE2 in Wasserproben (Oberflächenwasser und Kläranlagenablauf) erstmalig auf bis zu 0,2 ng/L abgesenkt werden. Gleichzeitig ist es gelungen, die Materialkosten für eine solche Bestimmung auf ca. 1,20 EUR zu reduzieren und die parallele Messung von 24 Proben in 40 Minuten zu ermöglichen. Es wurden somit die Grundlagen für eine sensitive und zugleich kosteneffiziente Routinemethode zur Bestimmung von EE2 in der aquatischen Umwelt geschaffen.
date: 2005
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6012/1/online_Version_Entwicklung_Optimierung_und_Validierung_eines_Immunoassays_zur_sensitiven_Detektion_des_endokrinen_Disruptors_17alpha_Ethinylestradiol.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00006012
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-60128
identifier:   Schneider, Christian  (2005) Entwicklung, Optimierung und Validierung eines Immunoassays zur sensitiven Detektion des endokrinen Disruptors 17alpha-Ethinylestradiol.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6012/
rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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language: ger