title: Gen- und Proteinexpressionsanalysen an primären Rattenhepatozyten
creator: Beigel, Jürgen
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: Tiermodelle sind in der pharmazeutischen Forschung eine teure und oftmals ineffiziente Methode, um Sicherheitsrisiken für den Menschen aus den gewonnenen toxikologischen Daten abzuleiten. Daher spielen, besonders in der frühen Phase der Arzneimittelforschung und  entwicklung, In vitro-Systeme wie primäre Rattenhepatozyten und die verstärkt aufkom-menden Genomics- und Proteomics-Technologien eine immer bedeutendere Rolle in der toxikologischen Forschung.  Ein erstes Ziel dieser Arbeit war, dieses In vitro-System als potentiellen Ersatz für traditionelle In vivo-Experimente zu charakterisieren. Da bereits bekannt war, dass primäre Rattenhepatozyten in Kultur an Aktivität verlieren (z.B. Xenobiotika metabolisierende Enzyme), wurde die Auswirkung der Kulturdauer auf die Genexpression mittels eines Low-Density- und eines High-Density-Microarray-Systems untersucht. Die Analyse der Protein-expression wurde durch 2D-Gelelektrophorese und SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight) durchgeführt. Das zweite Ziel war eine Validierungs-studie des beschriebenen Zellsystems. Hierzu wurden Zellen mit dem bekannten Hepatotoxin Acetaminophen behandelt und dosisabhängige Gen- und Proteinexpressionsveränderungen ermittelt. In der durchgeführten Zeitserie kam es, insbesondere nach 24 h, zu einer deutlichen Repression von wichtigen, in den Xenobiotika-Metabolismus involvierten Phase-I- und Phase-II-Enzymen (z.B. P450-Monooxygenasen, Glutathion-S-Transferasen, Sulfotrans-ferasen) und antioxidativ wirkenden Enzymen (z.B. Katalase, Glutathionperoxidase, Super-oxiddismutase). Bei den induzierten Enzymen handelte es sich vielfach um Akute-Phase-Enzyme (z.B. α-2-Makroglobulin, LPS-Binding-Protein, Ferritin, Serinproteinase-Inhibitor B, Haptoglobin), deren Regulation auf eine Stressantwort durch die Perfusion zurückzuführen war. Parallel dazu kam es durch proliferierende Zelltypen (vorwiegend Fibroblasten und Epithelzellen) und dedifferenzierende Hepatozyten in den Kulturen zu einem Ansteigen der Expression von Strukturgenen (z.B. β-Actin, α-Tubulin, Vimentin).  Der In vivo-Effekt eines Enzymwechsels während der Leberperfusion von Collagenase D zu Liberase Blendzyme führte zu signifikanten Veränderungen sowohl in der Gen- als auch der Proteinexpression und konnte durch alle angewandten Technologien detektiert werden. Diese Ergebnisse verdeutlichten das enorme Potential der durchgeführten Genomics- und Proteomics-Methoden. Die Behandlung mit Acetaminophen führte auf der Ebene der Genexpression zu deutlichen Veränderungen. Auf der Proteinexpressionsebene wurde ebenfalls ein Anstieg sowohl an induzierten als auch reprimierten Proteinen nach der Acetaminophen-Dosierung detektiert. Zusätzlich konnte hier ein erwarteter dosisabhängiger Effekt erkannt werden. Überein-stimmende Veränderungen mit der Zeitserie konnten dagegen weder in der Gen- noch in der Proteinexpression festgestellt werden. Die im Zeitverlauf massiv auftretenden Veränderungen in den primären Hepatozyten ohne Behandlung lassen darauf schließen, dass durch Acetaminophen hervorgerufene Effekte zum größten Teil überlagert wurden.  Wenngleich es nach nur einer getesteten Substanz verfrüht erscheint abschließende Aussagen über das Zellkultursystem zu machen, können doch einige Rückschlüsse gezogen werden. Zum Einen stimmten die Ergebnisse aus den beiden eingesetzten Microarray-Systemen und der quantitativen Real-Time PCR überein. Dadurch validierten sich die Resultate der analysierten Plattformen gegenseitig. Zum Anderen kam es bei der Mehrzahl der identifi-zierten Proteine ebenfalls zu einer hohen Korrelation zwischen Gen- und Proteinexpression. Hierbei auftretende grundlegende Unterschiede lassen auf posttranskriptionelle Regulations-mechanismen schließen.  Als Fazit lässt sich sagen, dass die potentiellen Einsatzmöglichkeiten und Vorteile der getesteten Methoden die Nachteile überwiegen. Allerdings ist es wichtig, diese Methoden nicht in Konkurrenz zueinander, sondern einander ergänzend einzusetzen, um ein möglichst umfassenendes Bild auftretender Zelltoxizität auf molekularer Ebene zu erhalten. Primäre Rattenhepatozyten erscheinen unter den getesteten Kulturbedingungen für Gen- und Protein-expressionsanalysen bis maximal 24 h als sinnvoll. Für mittel- bis langfristige Toxizitäts-studien ist die weitere Entwicklung brauchbarer Zellkultursysteme dringend erforderlich, um ihre Vorteile Schnelligkeit, Kosten und hohe Sensitivität zur Vorhersage möglicher Arznei-mitteltoxizität einzusetzen.
date: 2005
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6103/1/Dissertation.Juergen.Beigel.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00006103
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-61038
identifier:   Beigel, Jürgen  (2005) Gen- und Proteinexpressionsanalysen an primären Rattenhepatozyten.  [Dissertation]     
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rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
rights: http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/help/license_urhg.html
language: ger