TY  - GEN
AV  - public
ID  - heidok6218
Y1  - 2005///
TI  - Untersuchungen zu Struktur und Mechanismus eines Diels-Alder Ribozyms
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6218/
N2  - Das Forschungsgebiet der katalytischen RNA hat sich seit der Entdeckung der natürlichen Ribozyme stark weiterentwickelt. Neben der Erforschung der natürlichen Ribozyme hat sich mit der SELEX-Technik (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, künstliche Ribozyme herzustellen. Damit gelang es, die Bandbreite der durch Ribozyme katalysierbare Reaktionen enorm zu erweitern. Unter anderem konnte ein künstlicher RNA Katalysator generiert werden, der eine C-C-Bindungsknüpfung in einer [4+2]-Cycloaddition, eine sogenannten Diels-Alder Reaktion, katalysiert. Dieser künstliche RNA-Katalysator beschleunigt die Reaktion zwischen Anthracen- und Maleimidderivaten als erstes künstliches Ribozym in einer echten enzymatischen Katalyse. Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag in der Aufklärung von Struktur und Mechanismus dieses Diels-Alder Ribozyms. Mit der Synthese verschiedener Maleimidderivate und der Untersuchung derer Substrateigenschaften für das Diels-Alder Ribozym konnte die räumliche Struktur und Beschaffenheit des aktiven Zentrums charakterisiert werden. Die Synthese von photoreaktiven Maleimidsubstraten, und der Einsatz dieser in Photoaffinitätsmarkierungexperimenten erlaubten eine erstmalige genaue Lokalisierung des aktiven Zentrums des Ribozyms. Mit der Herstellung schweratommodifizierter Ribozym-Produkt-Konstrukte für die Lösung des Phasenproblems, konnte ein Beitrag zur Lösung der Kristallstruktur geleistet werden. Die Kristallstrukturen des Ribozym-Produkt-Komplexes und des ?freien? Ribozyms zeigten sich in guter Übereinstimmung mit den zuvor erhaltenen Ergebnissen aus Substratvariationstoleranzuntersuchungen und Photoaffinitätsmarkierungsexperimenten. Aus dem Kontext dieser Ergebnisse konnte ein konkretes Bild der Struktur-Funktionsbeziehung des Diels-Alder Ribozyms entworfen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die RNA eine ?-förmige verschlungene Pseudoknoten Struktur mit einer vorgeformten Bindungstasche besitzt. Diese Struktur ermöglicht die Katalyse über ?proximity?-Effekte im aktiven Zentrum und durch Stabilisierung des Übergangszustandes. In Untersuchungen der Enantioselektivität des Ribozyms konnte eine Abhängigkeit der Enantioselektivität vom verwendeten Reaktionsformat gezeigt werden. In der intramolekularen Katalyse (in cis-Format) erhält man eine genau umgekehrte Enantioselektivität zu der in intermolekularer Katalyse (in trans-Format) erhaltenen Enantioselektivität. Zur Erklärung dieser außergewöhnlichen stereoselektiven Eigenschaft wurde ein kontrollierter Zugang zum aktiven Zentrum durch eine ?Vordertür? oder eine ?Hintertür? postuliert. Die Existenz eines solchen kontrollierten ?Hintertürzugangs? zum aktiven Zentrum konnte in weiteren Untersuchungen zur Enantioselektivität unter Verwendung unterschiedlicher Ethylenglykollinkerlängen in der intramolekularen Katalyse (in cis-Format) untermauert werden. Auf der Basis dieser Ergebnisse konnte ein Modell zur stereoselektiven Erkennung erstellt werden, welches als ?3-Punkt-1- Orientierung? Modell bezeichnet werden kann.
A1  - Wombacher, Richard
ER  -