%0 Generic
%A Schmut, Nicole
%D 2006
%F heidok:6552
%K Hepatitis-B-Virus der Ente , Carboxypeptidase D , Viruseintritt , proteolytischer SchnittDuck hepatitis B virus , duck Carboxypeptidase D , virus entry
%R 10.11588/heidok.00006552
%T Analyse der Carboxypeptidase D-unabhängigen und -abhängigen Schritte bei der Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus der Ente
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6552/
%X Das Hepatitis-B-Virus der Ente (DHBV) zählt zur Familie Hepadnaviridae, einer Gruppe umhüllter DNA-Viren, die sich durch eine enge Wirts- und eine vorwiegend auf Hepatozyten beschränkte Gewebespezifität auszeichnen. Diese doppelte Restriktion im Tropismus wird in erster Linie durch die frühen Schritte des viralen Lebenszyklus bestimmt: (i) die Bindung des Virions an Rezeptormoleküle auf der Oberfläche der Wirtszelle, (ii) die endozytotische Aufnahme in die Zelle und (iii) die anschließende Membranfusion, die zur Freisetzung des Nukleokapsids in das Zytoplasma führt. DHBV kann sowohl in vivo in der Pekingente als auch in vitro in primären Entenhepatozyten (PDH) leicht propagiert werden und stellt deshalb ein unverzichtbares Modellsystem dar, die frühen Schritte der hepadnaviralen Infektion zu entschlüsseln. Eine essentielle Funktion hierbei wohnt der preS-Domäne des großen viralen Hüllproteins inne. Als zellulärer preS-Interaktionspartner ist die Carboxypeptidase D der Ente (dCPD) beschrieben. Sie bindet in einem ungewöhnlichen 2-Stufen-Mechanismus zunächst mit niedriger Affinität an einen Bereich innerhalb von preS (AS 86 - 115), der eine amphipathische alpha-Helix umfasst, und dann linear fortschreitend an N-terminal davon gelegene Aminosäuren (AS 30 - 85), woraus sekundär ein hochaffiner Komplex resultiert. Um die funktionelle Bedeutung der Interaktion von preS mit dCPD zu untersuchen, wurden Punktmutationen in die alpha-Helix eingeführt, die entweder zur Änderung der Ladungsverteilung oder der Aufhebung der strukturellen Integrität führten. Der Phänotyp dieser preS-Mutanten wurde biochemisch bezüglich der dCPD-Bindefähigkeit charakterisiert: während die Änderung der Amphipathizität ohne Auswirkung blieb, führte die Störung der Helixstruktur zu einer drastischen Reduktion oder zu einem vollständigen Verlust der dCPD-Interaktion. Der Verlust der dCPD-Bindekompetenz war streng korreliert mit einer Aufhebung der Infektiosität der entsprechenden Viren auf PDHs. Erstaunlicherweise wurden diese Defektmutanten unvermindert von Hepatozyten gebunden und internalisiert. Diese Ergebnisse bestätigen die essentielle Funktion der dCPD bei der DHBV-Infektion, sprechen aber gegen eine Rolle als exklusiver Binde- und Aufnahmerezeptor. Synthetische myristoylierte Peptide, die den N-Terminus des preS (AS 2 - 41) umspannen, kompetitieren äußerst effizient mit der DHBV-Infektion. Um den hierbei adressierten Schritt beim Viruseintritt näher zu definieren, wurden gegen die Peptide gerichtete Antikörper generiert. Diese konnten sowohl virale Partikel präzipitieren als auch ihrerseits selbst die Infektion blockieren, obwohl das von ihnen erkannte Epitop (AS 12 - 23) nicht mit der dCPD-Binderegion überlappt und in vitro keine Interferenz mit der dCPD-Interaktion nachweisbar war. Hieraus lässt sich folgern, dass der N-terminale preS-Bereich einen distinkten Schritt beim Viruseintritt vermittelt, der von der preS-dCPD-Komplexbildung funktionell klar abgrenzbar ist In DHBV-infizierten Entenlebern findet sich regelmäßig eine verkürzte Variante des großen viralen Hüllproteins. Durch die massenspektrometrische Analyse dieser Variante konnte eine putative Proteaseschnittstelle in der preS-Domäne unmittelbar nach den Argininen an Position 71 und 72 identifiziert werden. Der Austausch beider Aminosäuren führte zu einem vollständigen Verlust der Infektiosität ohne die Bindefähigkeit an dCPD und Hepatozyten zu beeinträchtigen. Dieser Befund impliziert eine proteolytische Prozessierung des großen Hüllproteins als notwendigen Teilschritt des Eintrittgeschehens. Aus den erhobenen Daten lässt sich ein mehrstufiges Modell des Eintritts von DHBV in die Wirtszelle ableiten. Das Virus bindet zunächst an einen bislang unbekannten Faktor auf der Hepatozytenoberfläche. Nach der Internalisierung erfolgt obligat der preS-abhängige Transfer auf dCPD. Die postulierte proteolytische Prozessierung könnte anschließend zur Freisetzung eines fusiogenen Peptids führen, dessen Aktion durch die homologen synthetischen Peptide inhibiert wird.