%0 Generic
%A Rajagopala, Seesandra Venkatappa
%D 2006
%F heidok:6577
%R 10.11588/heidok.00006577
%T The Protein-protein Interaction Map of the Treponema pallidum Flagellar Apparatus
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6577/
%X Diese Studie stellt den ersten umfassenden Versuch dar, die Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) eines bakteriellen Flagellenapparats genomweit zu erfassen. Wir haben dafür Treponema pallidum ausgewählt, also Spirochäten, die auch die Syphilis auslösen. T. pallidum hat ein kleines Genom mit nur 1,041 Genen, die alle in klonierter Form vorliegen. Die Flagellen von Spirochäten besitzen ausserdem einige spezielle Eigenschaften wie die periplasmatische Lokalisation der zwei polaren Flagellenbündel, welche sie für vergleichende Analysen besonders interessant machen Im Lauf dieses Projekts habe ich eine Yeast two-hybrid-Bibliothek des Treponema pallidum-Proteoms konstruiert und damit umfassende genom-weite Screens mit allen 75 Flagellen- und Motilitäts-Proteinen durchgeführt. Insgesamt wurden dabei 268 PPIs zwischen 174 verschiedenen Proteinen identifiziert. Davon waren zuvor nur 15 homologe Interaktionen (“Interologe”) aus der Literatur bekannt. Um die funktionelle Bedeutung dieser neuen Interaktionen für die bakterielle Motilität zu untersuchen, habe ich zuerst 23 Orthologe aller Treponema-Interaktoren in E. coli und 30 in B. subtilis vorhergesagt. Die Gene von 23 Orthologen wurden dann in E. coli und/oder B. subtilis (7 Gene) mutiert und deren Phänotyp in Motilitätsassays überprüft. Ich fand dabei 10 neue Proteine in E. coli (amiA, bcsC, rfaH, rpe, rpmJ, ycfH, yciM, yggH, yggW, und yncE) und 5 Proteine in B. subtilis (yaaT , yhbE/YhbF, yllB, yloS und yviF), deren Treponema-Homologe mit Flagellenproteinen interagierten und deren Mutanten einen Motilitätsphänotyp zeigen. Aufgrund ihrer Interaktionen und Phänotypen konnte ich 8 bisher nicht charakterisierten Proteinen eine Rolle als Motilitätsgene zuordnen, und zwar TP0046 (yaaT), TP0048 (yhbE/yhbF), TP0383 (yllB), TP0421 (yncE), TP0561 (ydjH), TP0658 (yviF), TP0712 (HP1034) and TP0979 (tatD). Basierend auf den 268 two-hybrid-Interaktionen konnte ich ausserdem 1455 Interaktionen in 30 anderen Bakterien vorhersagen. Mit 35 Flagellenproteinen von 30 Bakterienarten habe ich ausserdem einen phylogenetischen “Super-Stammbaum” erstellt, der die Flagellenapparate in einen evolutionären Kontext stellt und belegt, dass die Spirochäten einen ungewöhnlichen und abgeleiteten Flagellenapparat aufweisen. Ein Protein unbekannter Funktion, TP0658 (yviF in B. subtilis) wurde näher untersucht. Die Y2H-Interaktionen von TP0658 mit Flagellinen (flaB1-3) wurden biochemisch verifiziert. TP0658 bindet an eine C-terminale Sequenz von FlaB1 zwischen L231 und D247 (dem so genannten C-Loop der Flagelline). Dieses epitop ist in B. subtilis und anderen Bakterien konserviert. Ein hochkonserviertes Asparagin (N237 in FlaB1 bzw. N255 in B. subtilis hag) ist entscheidend für die Bindung. Eine ΔyviF Mutante in B. subtilis hatte einen starken Motilitätsphänotyp und keine nachweisbaren Flagelline. Koexpression von TP0658 und FlaB1 in E. coli stabilisiert FlaB1. Interessanterweise binden sowohl TP0658 als auch FliS (ein bekanntes aber nicht verwandtes Chaperon) an das gleiche Epitop in Flagellin, welches bei dessen Polymerisierung beteiligt ist. Meine Daten sprechen daher dafür dass TP658 und seine Verwandten “Assembly-Chaperone” der bakteriellen Flagelle sind.