TY  - GEN
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6661/
A1  - Roth, Christian Michael
N2  - Die Arbeiten von ERNST ABBE in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts brachten der Mikroskopie eine neue Leistungsfähigkeit und konnten so die Forschungs¬möglich¬keiten in der Biologie, vor allem in der Botanik, Zellbiologie und Mikrobiologie, und der Medizin deutlich verbessern. Im Jahr 1930 wurde die Fluoreszenzmikroskopie entwickelt und eröffnete völlig neue Möglichkeiten. Bis heute wurden zahlreiche Varianten der Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Hervorzuheben sind dabei die stimulierte Emissionslöschung (Abk.: STED), sowie die Einzelmolekül¬fluoreszenz¬spektroskopie (engl.: single molecule fluorescence spectroscopy, Abk.: SMFS), zu denen Methoden, wie Totalreflexions-Fluoreszenz Mikroskopie (engl.: total internal reflection fluorescence microscopy, Abk.: TRIFM) und die konfokale Einzelmolekül¬fluoreszenzmikroskopie gehören. Die Stärke der Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie liegt in der geringen Konzentration der verwendeten, fluoreszenten Sonden. Der Einsatz solcher Sonden kann wiederum als Reporter für molekulare Interaktionen dienen, oder strukturelle Änderungen, z.B. in der Nanoumgebung, aufzeigen, die eine Heterogenität besitzen. Die Entwicklungen im Bereich der optischen Techniken, ermöglicht eine höhere Auflösung sogar unter die Auflösungsgrenze von ABBE (STED). Dies eröffnet den Biowissenschaften neue Einblicke in molekulare Prozesse in Zellen und leistet somit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der komplexen Vorgänge in lebenden Organismen. Im Gegensatz zu Ensemble-Methoden, welche nur einen Mittelwert wiedergeben, kann man durch Betrachtung einzelner Moleküle Subpopulationen auflösen. Zu den Parametern, die der SMFS zugänglich sind, gehören die Fluoreszenzintensität, die Fluoreszenzlebensdauer, Orientierung des Dipols oder die Wellenlänge. Die Verwendung der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (engl.: fluorescence correlation spectroscopy, Abk.: FCS) ermöglicht eine Analyse der Dynamik innerhalb eines gewählten Zeitfensters. Dabei können Diffusions¬geschwindigkeit von Fluorophoren, aber auch photophysikalische Übergänge und der Konformation beobachtet werden. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung neuer Methoden der SMFS für Untersuchungen in lebenden Zellen, insbesondere von Transportprozessen. Daher setzt sich diese Arbeit im Wesentlichen mit zwei Schwerpunkten auseinander: (i) das gezielte Einschleusen fluoreszierender Sonden in lebenden Zellen, (ii) die Entwicklung einer Methode zur Beobachtung von schnellen Transport- und Diffusionsprozessen in lebenden Zellen. Die Verfügbarkeit endogen erzeugter Fluoreszenzfarbstoffe, also innerhalb der Zelle synthetisierter Farbstoff, ist begrenzt. Aufgrund der zusätzlichen geringen Photostabilität und komplizierter Photophysik, bedarf es hier alternativer Methoden. Organische Fluorophore, die entweder endogen oder exogen an den Protagonisten, z.B. ein Protein, gekoppelt werden, müssen die Zellmembran, entsprechend vor oder nach der Kopplung durchqueren. Dieser Transport wird durch die Zellmembran erschwert. Die Internalisierung solcher Stoffe kann z.B. durch Rezeptor vermittelten Transport oder Endozytose geschehen. Jedoch ist der Anspruch an den Transporter und seine Fracht in Bezug auf Größe und Form sehr hoch. Durch manuelle Methoden wie die Elektroporation oder Mikroinjektion werden die Zellen gestresst oder geschädigt und bieten nur bedingt eine Alternative mit Zukunft. Die Verwendung von zellmembrangängigen Proteinen ist in den vergangenen Jahren zu einer neuen Methode zur Aufnahme in Zellen gereift. Die Peptide sind für die pharmazeutische Industrie aufgrund der Zellmembrangängigkeit, die auch zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke ausgenutzt werden könnte und somit Arzneistoffe direkt in die entsprechenden Zellen transportiert, von großer Bedeutung. Zellmembrangängige Proteine, die in Viren oder auch in eukaryotischen Zellen vorkommen, gelangen durch die Zellmembran direkt in den Zellkern, um sich schließlich in den Nukleoli anzureichern. Bisherige Untersuchungen der viralen Proteine, wie z.B. das Tat-Protein des HI-Virus, haben gezeigt, dass die Aminosäuren Arginin und Lysin für den Erkennungs- und Aufnahmeprozess verantwortlich sind. Entsprechende Modifikationen des Tat-Proteins wurden teilweise sogar besser von den Zellen aufgenommen, als das Tat-Protein selber. Durch Verwendung von Homologen zu den nativen Aminosäuren besteht die Möglichkeit, die Peptide resistenter gegen einen möglichen Abbau durch Peptidasen zu machen. In Kooperation mit Prof Dr. D. SEEBACH, von der ETH-Zürich, wurden HeLa-Zellen mit Fluorescein markierten ?-Peptiden inkubiert. Die inkubierten ?-Peptide, basierend auf den ?-Aminosäuren, konnten mit Hilfe der Fluoreszenz des Farbstoffes mittels Fluoreszenz¬mikroskopie beobachtet und dokumentiert werden. Ebenso wie bei den ?-Peptiden konnte bei den ?-Peptiden das typische Anfärbungsmuster der Zellen ab einer Peptidlänge von acht Aminosäuren beobachtet werden. Das Dekamer wurde nahezu in allen Zellen vor allem in den Nukleoli gebunden. Die Aufnahmeeffizienz erfolgte nicht kontinuierlich über die Konzentration, sondern benötigte eine bestimmte Schwellenkonzentration, ab der der Internalisierungsprozess stattfindet. Durch die Experimente über das Aufnahmeverhalten der ?-Peptide in Zellen zeigten sich die Peptide als zuverlässige Transporter für molekulare Fracht durch die Zellmembran hindurch. Mit Hilfe dieses Transporters können neben Pharmazeutika, auch fluoreszente Sonden für die Diagnostik eingeschleust werden. Die Verwendung des Transporters für die Einschleusung fluoreszenter Sonden kann helfen, Signal- und Transportprozesse in der Zelle zu verfolgen. Durch Einschleusen einer Sonde und Aussetzen in der Nanoumgebung einer Zelle kann es, z.B. zur Verlangsamung durch Interaktionen, aber auch zu einer Erhöhung der Diffusion durch aktiven Transport kommen. Im Folgenden galt es eine Methode zu entwickeln, die derartige Unterscheide sichtbar machen. Die Kombination der konfokalen, zeitaufgelösten Einzelmolekül¬fluoreszenz¬mikroskopie (engl.: fluorescence lifetime imaging microscopy, Abk.: FLIM) mit der FCS ermöglicht die Verbindung der Vorteile zweier empfindlicher Methoden. Während FLIM mit einer hohen Empfindlichkeit Photonen einzelner Fluoreszenzfarbstoffe mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung detektieren kann, liefert die FCS Informationen über die Dynamik in dem beobachteten Bereich. Durch die Beobachtung mehrerer diffundierender Moleküle, z.B. in Lösung lassen sich, durch die aus der Fluoreszenz¬fluktuation erhaltene Korrelation, Aufschlüsse über die Dynamik, z.B. die Wechselwirkungen zwischen der Sonde und der Nanoumgebung, in dem beobachteten System geben. Die Verbindung der beiden Techniken erzeugt eine Diffusionskarte des beobachteten Systems, wie z.B. einer Zelle. Unterschiede in der Diffusionszeit können so Aufschlüsse über die fluoreszenten Reporter geben, die z.B. durch Interaktionen der fluoreszenzmarkierten Protagonisten mit zellulären Komponenten auftreten oder aufgrund erhöhter Viskositäten längere Diffusionszeiten erfahren. Auch aktiver Transport z.B. entlang von Microtubuli ließe sich von der normalen Zelldiffusion diskriminieren. Bisherige Arbeiten, welche diese Techniken verknüpften brachten das Scanning-FCS hervor. Durch schnelles mehrmaliges Abtasten eines Bereiches einer Probe konnten bisher lediglich langsamere Diffusionsprozesse von Membranproteinen beobachtet werden. In dieser Arbeit wird die Entwicklung der bildgebenden Diffusions¬mikroskopie gezeigt, die eine Kombination aus FLIM und FCS darstellt und auch schnellere Diffusionsprozesse bis in den Mikrosekundenbereich abbilden kann. Die Methode der bildgebenden Diffusionsmikroskopie wurde an verschiedenen Systemen getestet, um die Anwendbarkeit abzuschätzen. Die ersten Versuche Heterogenitäten in Lösungen zu erkennen wurden mit einer Spitze einer Mikrokapillare erreicht, die in eine Lösung mit einem Farbstoff markiertem Oligonukleotid eintauchte. Zwei Elektroden, eine davon in der Mikrokapillare als Anode, sorgten für eine gerichteten elektrophoretischen Fluss der Oligonukleotide zur Öffnung der Mikrokapillare und auch hinein. Beobachtet wurde ein Anstieg der Diffusionszeit innerhalb der Kapillaröffnung. Da die Moleküle entlang der optischen Achse wanderten, befanden sie sich, auf Grund der ellipsenartigen Asymmetrie des Laserfokus, länger im Beobachtungsvolumen und ergaben so länger Diffusionszeiten. Diese Experimente zeigten dass es möglich ist in der Diffusion räumlich aufgelöst darzustellen. Die Entwicklung der bildgebenden Diffusionsmikroskopie für zelluläre Systeme eröffnet die Möglichkeit Diffusionsprozesse über eine ganze Zelle hinweg zu beobachten. Zu diesem Zweck wurden wiederum fluoreszente Farbstoffe, als Sonden an ein dT20-Oligonukleotid gekoppelt, eingesetzt. Die Analyse der mittels der bildgebenden Diffusionsmikroskopie zeigte Heterogenitäten in der Diffusion. Prinzipiell wurde damit die Möglichkeit geschaffen die Einschleusung fluoreszenter Sonden, wie z.B. beta-Peptiden, zu untersuchen
Y1  - 2006///
TI  - Untersuchungen in lebenden Zellen mit Hilfe neuer Methoden der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie
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ID  - heidok6661
ER  -