title: Regulation der Genexpression bei der Erythroiden Differenzierung
creator: Knoth, Stefan
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: Stefan Knoth Titel: Regulation der Genexpression bei der erythroiden Differenzierung Betreuer: Prof. Dr. Stefan Wölfl Zusammenfassung Viele Erkrankungen des blutbildenden Systems, insbesondere Leukämien, haben ihre Ursache in einer Störung der Differenzierungvorgänge, die ausgehend von undifferenzierten Stammzellen des Knochenmarks zu allen Arten von hochspezialisierten Blutzellen führen. Es ist bekannt, dass sich bei der Chronischen Myeloischen Leukämie (CML) mit verschiedenen Substanzen wie AraC oder Butyrat die Proliferation unterdrücken und eine weitere Differenzierung induzieren lässt. Bei CML-Zellen geht man davon aus, dass durch die genannten Chemikalien die Differenzierung in Richtung der erythroiden Reihe stimuliert wird, da verstärkt Hämoglobine synthetisiert werden. Wegen ihrer einfachen Handhabung in Kultur wurden diese Zellsysteme in der Vergangenheit häufig als Modelle zur Untersuchung der erythroiden Differenzierung verwendet. Die therapeutikastimulierte erythroide Differenzierung von CML-Zellen ist also in zweierlei Hinsicht interessant, einerseits aus medizinischer Sicht zur Bewertung der Vorgänge im behandelten Patienten und andererseits hinsichtlich der Eignung dieser Systeme als Modelle zur Erforschung der Erythropoese.  In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen des Transkriptoms als Maß für Differenzierungsprozesse herangezogen. Die Entwicklung von Erythrozyten aus Vorläuferzellen wurde in vier Zellkultursystemen untersucht, die als Modelle für diesen Differenzierungsweg allgemein anerkannt sind. Als Modell für die normale Erythropoese dienten CD34-positive hämatopoetische Vorläuferzellen, die mit Erythropoietin stimuliert wurden. Die drei anderen Modelle basieren auf der CML-Zelllinie K562, wobei die Zellen mit AraC, Natriumbutyrat oder Hämin behandelt wurden. Bei allen Modellen wurden Zellproben in Form von Zeitreihen entnommen. Mit Hilfe der aus den Zellen präparierten total-RNA wurden Hybridisierungsproben hergestellt und auf AFFYMETRIX-U133A-Microarrays hybridisiert.  Alle untersuchten Zeitpunkte wurden definierten Stadien der Erythropoese zugeordnet. Dazu wurden FACS-Daten bekannter Oberflächenmarker, morphologische Kriterien sowie Array-Daten einer Vielzahl weiterer erythrozytenspezifischer Gene benutzt. Die überwiegende Mehrheit der Zellen im CD34+-Experiment erreichte die letzten kernhaltigen Stadien Proerythroblast, Erythroblast und Normoblast, vollendete aber die erythroide Differenzierung nicht. Bei den K562-Experimenten ermöglichte der Vergleich der kompletten Datensätze mit den Datensätzen des CD34+-Experiments durch hierarchisches Clusterns ebenfalls eine Zuordnung zu definierten Stadien der Erythropoese.  Anschließend wurden die Datensätze nach differentiell exprimierten Genen durchsucht. Im Ergebnis wurden bei den EPO-stimulierten CD34+-Zellen 2363 Gene, bei den AraC-stimulierten K562 1987 Gene, bei den Butyrat-stimulierten K562 1941 Gene  und bei den Hämin-stimulierten K562 850 Gene als differentiell exprimiert eingestuft. Um festzustellen, welche Gene in allen oder zumindest mehreren Modellen reguliert werden, wurden die Schnittmengen berechnet. Wegen der geringen Übereinstimmung der Modelle und unter der Annahme, dass das CD34+-Modell die in-vivo-Bedingungen am besten repräsentiert, wurde festgestellt, dass die therapeutikastimulierten K562 als Modelle der Erythropoese ungeeignet sind. Daher wurde im Weiteren nur das CD34+-Modell untersucht. Mittels k-means-clustering wurden regulierte Gene mit ähnlichen Expressionsverläufen innerhalb einer Zeitreihe zu Gruppen (Cluster) geordnet. Dadurch konnten verschiedene Aktivierungsmuster unterschieden werden. Innerhalb der Cluster wurde nach Genen gesucht, deren Produkte an der biochemischen Signaltransduktion beteiligt sind und in einer funktionellen Beziehung zueinander stehen. Die Bedeutung dieser Veränderungen für die regulatorischen und metabolischen Reaktionswege in der Zelle wurde erörtert.  Die therapeutikainduzierte Differenzierung von K562 ist zwar kein ideales Modell der Erythropoese, ist aber von großem Wert bei der Beschreibung der biologischen Vorgänge, die bei einer Chemotherapie im Patienten stattfinden. In diesem Zusammenhang wurde konkret nach regulatorischen Proteinen gesucht, deren Expressionsmuster sich in den K562-Modellen deutlich vom CD34+-Modell unterscheiden und die daher neben BCR-ABL für die Ausprägung des CML-Phänotyps wichtig sein könnten. Es wurde eine Auswahl von 18 Genen vorgestellt und für 14 von ihnen wurden die Array-Daten durch quantitative RT-PCR bestätigt. Mit Hilfe eines noch in Entwicklung befindlichen Microarrays mit phosphorylierungs-spezifischen Antikörpern war am Modell der CD34+-Zellen die Signalkaskade ausgehend von der Stimulierung mit Erythropoietin (EPO) zu verfolgen. Es wurde gezeigt, dass durch EPO die Phosphorylierung von AKT und p70S6-Kinase ausgelöst wird. Diese Ergebnisse konnten durch Immunoblots bestätigt werden.
date: 2006
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
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identifier: DOI:10.11588/heidok.00006682
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-66820
identifier:   Knoth, Stefan  (2006) Regulation der Genexpression bei der Erythroiden Differenzierung.  [Dissertation]     
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language: ger