%0 Generic
%A Schanné, Michaela
%D 2006
%F heidok:6846
%K GenotypisierungHIV , microarray , resistance testing
%R 10.11588/heidok.00006846
%T Microarray-basierte genotypische Resistenzbestimmung in HIV
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6846/
%X Eines der Hauptprobleme der antiviralen Therapie ist das Entstehen resistenzassoziierter Mutationen. Der Nachweis solcher Mutationen ist für eine erfolgreiche Therapie eine entscheidende Voraussetzung. In dieser Arbeit wurde ein Microarray zur Detektion von relevanten Mutationen innerhalb der Protease (PR) und –Reversen Transkriptase (RT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) entwickelt und validiert. Als zeit  und kostengünstigere Alternative zur routinemäßig eingesetzten Sanger-Sequenzierung wurde die Arrayed Primer Extension (APEX)-Methode zur genotypischen Resistenzbestimmung etabliert. Zur Abfrage von 26 resistenzassoziierten Codons innerhalb der PR- und 33 Codons innerhalb der RT-kodierenden Region wurden Oligonukleotide erstellt. Aufgrund der enormen Variabilität des HIV Genoms berücksichtigen diese alle Sequenzvarianten, die mit einer Frequenz von >5% (PR) bzw. >10% (RT) in der Los Alamos Datenbank verzeichnet sind. Um diese Sequenzabdeckung technisch und finanziell zu realisieren, wurde die Verwendung degenerierter Oligonukleotidsonden für APEX etabliert. Für die Validierung des PR  und RT Microarrays wurden 94 bzw. 48 PCR Produkte aus Patientenproben mit bekannter Sequenz analysiert. Dafür wurden die APEX-Reaktionsbedingungen erfolgreich angepasst. Die Vergleichssequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung ermittelt. 93% (PR) bzw. 88% (RT) aller untersuchten Positionen wurden mittels APEX übereinstimmend bestimmt. Der Anteil an Positionen, für die aufgrund schwacher Signalintensitäten keine Sequenzzuweisung vorgenommen werden konnten, liegt bei 3% (PR) und 5% (RT). Es wurde gezeigt, dass dieses Ergebnis durch Optimierung der Sonden deutlich verbessert wird. Die zufällig ausgewählten Proben umfassten sowohl HIV-Subtyp B  als auch nicht Subtyp B Sequenzen. Aufgrund der verwendeten Sonden ist die Übereinstimmung für die untersuchten Subtyp B Proben im Vergleich mit den nicht Subtyp B Proben höher (94% / 88% für PR; 88% / 84% für RT). Sequenzmischungen wurden qualitativ gut detektiert, eine Quantifizierung ist aber Sonden-abhängig. Der Fehlerbereich ist vergleichbar mit dem anderer Genotypisierungsmethoden. Das entwickelte Testverfahren kann kostengünstig mit hohem Probendurchsatz durchgeführt werden. Parallel zur HIV-Genotypisierung wurde anhand zweier Beispiele gezeigt, dass auch Mutationen im Wirtsgenom, die mit der Krankheitsprogression assoziiert sind, sehr gut mittels APEX nachgewiesen werden können. Dies wird künftig eine sinnvolle Ergänzung des Microarrays sein und eine individuellere Therapie ermöglichen.