%0 Generic
%A Belharazem, Djeda
%D 2006
%F heidok:6950
%K Immortalisierung , Primäre Fibroblasten , Knock in Maus , Tumorgenese , MationenHupki Fibroblasten , Arginin , Prolin P53 , immortalization , p53/p19ARF pathway
%R 10.11588/heidok.00006950
%T Immortalisierung embryonaler Fibroblasten aus Wildtyp und Hupki  (Human p53 knock-in) Mäusen durch Veränderungen des p19Arf/p53 Kontrollweges und Erst-Charakterisierung des neuen  Prolin 72-kodierenden  Hupki-Mausstamms
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/6950/
%X Aufgrund zunehmenden Wissens um die Regulation des Wachstums maligner Zellen können neue Therapieansätze gefunden werden. Dafür ist es notwendig, mehr über die komplexen  Mechanismen der Tumorentstehung und der unbegrenzten Proliferation, der Immortalisierung, von Zellen zu wissen.  Immortale Zellen besitzen im Unterschied zu normalen Zellen kein begrenztes Teilungsvermögen, welches abhängig von der Anzahl der Zellteilungen und der Länge der Telomere (Harley et al., 1990) ist. Genauso unterscheiden sich  Zelllinien von primären embryonalen (normalen) Zellen. Diese teilen sich bereits nach wenigen Passagen nicht mehr und treten in die Seneszenz ein, die mit charakteristischen morphologischen, zellphysiologischen, molekularen und biochemischen Veränderungen verbunden ist (Kanungo, 1994).   Murine und  humane Fibroblasten unterscheiden sich in den Mechanismen der Seneszenz: Der Hauptmechanismus der Seneszenz.   Die 20%ige Sauerstoff Atmosphäre der Zellkulturbedingungen übt in den primären, embryonalen murinen Fibroblasten (MEFs) einen oxidativen Stress auf die Zellproliferation aus.  P19/ARF-p53 scheint der wichtigste Regulationsmechanismus für die Seneszenz in diesen Zellen zu sein. Mit der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen wie z.B. p53 oder pRb durch Punktmutationen oder Deletionen kann die zelluläre Seneszenz unterbrochen und die Zelle zur Immortalisierung gebracht werden. Als Transkriptionsfaktor und Tumorsuppressor weist das p53- Gen Mutationen in 50% aller menschlichen Tumoren auf. Bekannt ist der p53- Polymorphismus im Codon 72 im Exon 4 in der Polyprolindomäne, das entweder für die Aminosäure Arginin (CGC) oder Prolin (CCC) kodiert. Beide Varianten zeigen biochemische Unterschiede im Zellzyklus, der Apoptose und der Tumorgenese-Regulation Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der spontanen Immortalisierungsrate der MEFs und der Hupki Maus Fibroblasten, die einen Teil des humanen Arginin p53- Gens vom Exon 4 zum Exon 9, HUFs R/R genannt, tragen (die HUFs wurden von der Humanen P53 knock in Maus (Hupki Maus) (Luo et al., 2001a) etabliert). Die MEFs weisen eine deutlich höhere Empfindlichkeit gegenüber der 20%igen Sauerstoffatmosphäre der Zellkulturbedingungen als die HUFs R/R auf. Nur ca. 10% (11 von 121) der gesamten primären Zellpopulationen überlebte die Seneszenz und traten in den Immortalisierungsprozess ein. Mehr als 60% der etablierten Zelllinien (7 von 11) weisen entweder p53 missense- Mutationen (5 von 7) vom Typ G>C oder C>G Transversion, mit einer Überexpression an p19 Protein, oder den p19/ARF- DNA Verlust (2 von7) auf. Dagegen verhielten sich die HUFs R/R, die in 90% der primären Zellklone zu immortalisierten Linien auswuchsen (109/120), deutlich resistenter gegenüber den angewandten reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygene species (ROS)) als die MEFs.  Nur 20% der HUFs Zellklone (4 von 20) weisen eine Punkmutation oder eine Deletion in der p53-DNA-Bindungsdomäne auf.  80% der restlichen Zelllinien sind nicht dadurch betroffen Die durchflusszytometrische Analyse der Apoptose mittels Annexin/PI- Kit zeigt, dass die stressigen in vitro Zellkulturbedingungen mehr primäre MEFs in die Apoptose treiben  als HUFs R/R.  Nachdem die erste Hupki Maus mit dem p53 Arginin Protein ein recht gutes Model für in vivo und in vitro Untersuchungen des humanen p53 Gens darstellt, wurde eine zweite Hupki Maus mit der Prolin- Variante hergestellt, um die multiplen Fragestellungen nach dem p53 Polymorphismus zu beantworten.  Die ersten im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten in vitro Studien zeigen in den Hupki Prolin (HUFs PP) Fibroblasten eine hohe Menge an p21 WAF in den klassischen in vitro Zellkulturbedingungen auf, die in den primären, embryonalen Hupki Arginin Fibroblasten. Erst nach Induktion mit gamma-Strahlen erreicht wurde. Dagegen weisen die HUF Zellen mit der p53 Arginin Variante eine Induktion der Perp (P53 apoptosis effactor related to PMP22) nach einer Gamma-Strahlen Exposition auf. Studien zeigten einen Zusammenhang zwischen dem heterozygoten Arg/Pro Genotyp und dem Lungenkarzinom (Fan et al.,  2000). Auch das Prolin- Codon  Pro/ Pro Genotyp weist eine Assoziierung mit Lungentumoren (Kawajiri et al., 1993) auf. Von 47, mit dem Prokarzinogenen Benzo(a)pyren B(a)P behandelten, primären, embryonalen heterozygoten Hupki Arginin/Prolin (HUFs RP) Zellpopulationen ließen sich 20 (42%) als Zelllinien etablieren: Davon weisen 25% der Zellklone eine p53 G>C, C>G oder C>T Punktmutation auf dem Prolin- Allel auf, gefolgt vom einem Verlust der Heterozygosität (LOH) des Arginin-Allels. Dieses Ergebnis scheint sich von der Immortalisierung der mit B(a)P behandelten Hupki hetereozygoten Arginin Fibroblasten (Liu et al., 2005) deutlich zu unterscheiden.