%0 Generic
%A Bierhoff, Holger
%D 2007
%F heidok:7282
%K rRNA synthesis , transcription , phosphorylation , gene regulation
%R 10.11588/heidok.00007282
%T Funktionelle Charakterisierung der CK2-vermittelten Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors TIF-IA bei der Regulation der Synthese ribosomaler RNA
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/7282/
%X In Säugern wird die ribosomale RNA von RNA-Polymerase I (Pol I) synthetisiert. Die Interaktion der Pol I-spezifischen Faktoren TIF-IA und TIF-IB miteinander sowie die Bindung von TIF-IB an den rDNA-Promotor sind für die Transkriptionsinitiation notwendig. Ein Guanin an Position -7 (G-7) im core promoter element des rDNAPromotors ist nicht für die Bindung von TIF-IB, jedoch für eine effiziente rRNA Synthese notwendig. Wie im Rahmen dieser Arbeit gezeigt wurde, führt eine G-7->A Transition in vitro und in vivo zu einer starken Inhibierung der Promotoraktivität. Transkriptionsanalysen mit immobilisierten rDNA-Matrizen sowie abortive Transkriptionsexperimente wiesen auf eine Hemmung der Assoziation von TIF-IA mit dem rDNA-Promotor durch die G-7 Mutation hin. Jedoch haben Transkriptionsanalysen unter single round-Bedingungen und nach Depletierung von TIF-IA gezeigt, daß TIF-IA für die Transkription an der mutierten Matrize erforderlich ist. Somit scheint ein bislang unbekanntes Protein an der Ausbildung des Prä-Initiationskomplexes beteiligt zu sein, das an G-7 bindet. TIF-IA ist ein Phospho-Protein, das an mehreren Serinresten, unter anderem auch an Serin 170 und 172, phosphoryliert wird. Ziel dieser Arbeit war es, die Phosphorylierung dieser Serinreste funktionell aufzuklären und die entsprechende Kinase zu identifizieren. Durch Herstellung einer nicht-phosphorylierbaren Mutante (TIF-IAS170A/S172A) konnte gezeigt werden, daß die Serine 170 und 172 durch Casein-Kinase 2 (CK2) in vitro und in vivo phosphoryliert werden. Die Analyse der transkriptionellen Aktivität sowie die Expression von TIF-IAS170A/S172A in TIF-IA knockout Zellen ergaben, daß TIF-IA ohne die CK2-vermittelte Phosphorylierung nicht funktionell ist. In Co- Immunpräzipitationsexperimenten wurde nachgewiesen, daß die Inhibierung der Phosphorylierung von Serin 170 und 172 eine verstärkte Bindung von TIF-IA an Pol I bewirkt, während die Interaktion mit TIF-IB nicht beeinflußt wird. Mit Hilfe eines Antiserums, das spezifisch Phospho-Serin 170 und 172 in TIF-IA erkennt, wurde gezeigt, daß die CK2-vermittelte Phosphorylierung die Bindung von TIF-IA an Pol I verhindert. Aufgrund dieser Daten ist anzunehmen, daß TIF-IA nach der Transkriptionsinitiation von CK2 phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung die Dissoziation von TIF-IA vom Elongationskomplex induziert. Diese CK2-vermittelte, reversible Phosphorylierung von TIF-IA ist somit für die produktive Elongation bzw. eine effiziente Re-Initiation essentiell.