%0 Generic
%A Knödler, Andreas
%D 2007
%F heidok:7339
%K Lipidphosphatasephosphoinositides , gene expression , promoter , lipid phosphatase
%R 10.11588/heidok.00007339
%T Expressionsregulation der Sac1 Lipidphosphatase in Saccharomyces cerevisiae
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/7339/
%X Phosphoinositide sind wichtige Lipidsignalmoleküle, die an der Regulation vieler intrazellulärer Vorgänge beteiligt sind. Sie werden durch das Zusammenspiel von spezifischen Lipidkinasen und Lipidphosphatasen reguliert, die selbst einer genauen Regulation unterliegen müssen. Die Lipidphosphatase Sac1p in Hefe kann PtdIns(4)P-Signale an Membranen des ER und Golgi-Apparates hydrolysieren. Dabei wird die räumliche Regulation und Koordination der katalytischen Aktivität von Sac1p durch einen Lokalisationswechsel zwischen ER und Golgi-Apparat gewährleistet. Außerdem wurde beobachtet, dass eine Regulation auf transkriptioneller Ebene stattfindet. So waren zelluläre Menge einer sac1- Variante mit reduzierter Phosphataseaktivität im Vergleich zu Wildtyp-Sac1p erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expressionskontrolle von SAC1 durch genetische und funktionelle Analysen untersucht. Mit Hilfe von verkürzten und mutierten Promotorkonstrukten konnte eine Region innerhalb des SAC1-Promotors identifiziert werden, die für die Transkription essentiell ist. So wurde gezeigt, dass die Deletion der Basen –100 bis –92 stromaufwärts des SAC1-Startcodons innerhalb des Gesamtlängepromotors zum Verlust der transkriptionellen Aktivität führt. Die Sequenz dieser essentiellen Region lautet ACCAGAGGT. Die jeweils äußeren drei Basen bilden dabei eine palindromartige Struktur aus. Mit Gelshiftanalysen konnte nachgewiesen werden, dass an die intakte Basensequenz ein bisher unbekannter Proteinfaktor bindet. Werden die jeweils äußeren drei Basenpaare deletiert, wird die Bindung des Proteinfaktors weitestgehend unterbunden. Wurden Oligonukleotide, die die spezifische Sequenz enthielten, an CNBr-Sepahrose gekoppelt, so war man in der Lage, spezifisch bindende Proteine in solchen Mengen aufzureinigen, die massenspektrometrischen Sequenzanalysen genügten. Jedoch konnte der bindende Faktor nicht identifiziert werden.  Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der SAC1-Promotor inositolsensitiv ist. Unter Inositolmangelbedingungen war die Promotoraktivität erhöht, Inositolüberschuss hatte eine Erniedrigung der Aktivität zur Folge. Zusammen mit dem bekannten Phänotpyen der Inositolauxotrophie einer sac1 D-Mutante, stellt dies einen Hinweis dar, dass die Expressionsregulation von SAC1 mit dem Lipidstoffwechsel gekoppelt ist. Die Analyse der SAC1-Expression im Zusammenhang mit der Regulation von Genen der Inositolbiosynthese hat jedoch ergeben, dass Inositol nicht das direkte Signal ist, welches die Promotoraktivität reguliert. Es konnte ebenfalls demonstriert werden, dass die Aktivität des SAC1-Promotors mit der intrazellulären PtdIns(4)P-Menge korreliert. So war der Promotor in sac1 D-Zellen, die durch zehnfach erhöhte PtdIns(4)P-Mengen charakterisiert wurden, deutlich aktiver. Wurden die sac1 D-Zellen mit temperatursensitiven Lipidkinasemutanten kombiniert, so sank die Aktivität des Promtors entsprechend der Reduktion von intrazellulärem PtdIns(4)P. Damit war ein Hinweis gefunden, dass intrazelluläres PtdIns(4)P das Signal sein könnte, das die Promotoraktivität von SAC1 steuert. Möglicherweise wird das Lipidsignal über spezifische lipidbindende Proteine von der Membran in den Nukleus transportiert. Mit Hilfe von biotinylierten, PtdIns(4)P-enthaltenden Lioposomen konnte eine Methode entwickelt werden, die es erlaubt, nach PtdIns(4)P-interagierenden Faktoren zu suchen. Diese Methode kann nicht nur für die Charakterisierung der Bindeeigenschaften lipidbindender Proteine eingesetzt werden, sondern auch für die Aufreinigung von Proteinmengen, die für eine Detektion durch Coomassiefärbung ausreichend sind. Durch weitere Aufskalierungen sollte man in der Lage sein, auch weniger abundante Proteine zu identifizieren, die spezifisch mit PtdIns(4)P interagieren können.