TY  - GEN
AV  - public
ID  - heidok7668
Y1  - 2007///
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/7668/
KW  - ribozyme
A1  - Bebenroth, Dirk
TI  - Über Struktur-Funktions-Beziehungen zur Architektur von Ribozymen für eine Diels-Alder-Reaktion
N2  - Bislang war nur wenig bekannt über die Struktur und Reaktionsmechanismen künstlicher Ribozyme. Von der Arbeitsgruppe Jäschke wurde 1999 ein künstliches hergestelltes Ribozym beschrieben, das eine Diels-Alder-Cycloadditionsreaktion katalysiert [1]. In der vorliegenden Arbeit wurden Struktur-Funktions-Beziehungen auf verschiedenen Ebenen untersucht: Zum einen auf der Ebene der Nukleotide durch konventionelle Mutagenese, zum anderen auf der Ebene funktioneller Gruppen entweder durch atomare Mutagenese mittels ortsspezifischer Substitutionen oder durch Nucleotide Analog Interference Mapping (NAIM). Die Existenz und Lage der drei helikalen Bereiche des Ribozyms konnte durch doppelte, komplementäre Basensubstitutionen in Aktivitätswiederherstellungsversuchen gestützt und somit die zuvor angenommene Sekundärstruktur bestätigt werden. Der Annahme folgend, dass das katalytische Zentrum des Ribozyms von den einzelsträngigen Bereichen ausgebildet wird, wurden durch Substitution einzelner Basen die Konservierungsgrade aller Positionen dieser Bereiche bestimmt. Durch einzelne 2´-Desoxynukleotidsubstitutionen an denselben Positionen wurde die Rolle der 2´-Hydroxylgruppen im Ribozymmolekül untersucht. Hierbei wurde insbeson-dere die Wichtigkeit der 2´-Hydroxylgruppe des Nukleotides G9 als Teilnehmer im zentralen Wasserstoffbrücken-Netzwerk des aktiven Zentrums deutlich. Darüber hinaus wurde die Bedeutung verschiedener Ringstickstoffe, Aminogruppen und Carbonylgruppen in NAIM-Experimenten untersucht. Hier stand unter anderem die G9-Aminogruppe im Fokus des Interesses, da diese offenbar mit einer Carbonylgruppe des Maleimid-Substrates interagiert. Daher könnte ihr eine wichtige Funktion im Katalysemechanismus zukommen. Im Rahmen der NAIM-Experimente konnten ferner Rückschlüsse auf die Wichtigkeit einzelner Magnesium-ionen zur Tertiärstrukturbildung gezogen werden. Zu diesem Zweck wurde die Rolle der nicht verbrückenden Phosphatsauerstoffe durch den Einbau von Phosphorothioatanaloga untersucht. Mit ihrer Etablierung gelang es erstmalig, die NAIM-Technik an einem nicht RNA-spaltenden Ribozym anzuwenden. Der Einbau einer zusätzlichen Anthracen-Modifikation erforderte die Lösung besonderer technischer Probleme, die durch spezielle und zum Teil selbstentwickelte Methoden gelöst werden konnten. Tertiäre Interaktionen des Pseudoknotenbasenpaares G1-C11 konnten erstmals durch eine partielle Aktivitätswiederherstellung in der Doppelmutante G1-C11 ? iso-G1-iso-C11 zweifelsfrei nachgewiesen werden. In RNA/DNA/2´-OMe-RNA-Chimären war es möglich, die Anzahl der benötigten Ribonukleo-tide auf elf zu senken, bei weitgehender Erhaltung der Katalyseaktivität. Weiterhin gelang es, die Aktivitätsdaten der Chimären in einen strukturellen Zusammenhang zu bringen, wobei insbesondere die Relevanz sterischer Hinderungen im Bereich der engen Schleife A18-C21.4 zu Tage trat. Auch die strukturelle Bedeutung der Helix II-Geometrie wurde in diesem Zusammenhang untersucht und diskutiert. Insgesamt konnte eine exzellente Übereinstimmung der Mutations- und Probingdaten untereinander sowie mit der kürzlich gelösten Kristallstruktur festgestellt werden. Bezüglich einer möglichen Quartärstruktur ergaben sich keine Anhaltspunkte für die Existenz von Di- oder Oligomeren, wodurch die Annahme einer monomeren Ribozymform gestützt wird. Atypisches kinetisches Verhalten legte eine partielle Inaktivierung des Ribozyms nahe. Zur Stützung dieser These wurde nach kovalenten Modifizierungen aus Nebenreaktionen gesucht; hierauf fanden sich jedoch keine Hinweise. Schließlich konnte experimentell gezeigt werden, dass auf dem Faltungsweg des Oligonukleotids die Ausbildung der Sekundärstruktur der geschwindigkeitsbestimmende und wesentlich langsamere Schritt gegenüber der Tertiärstrukturbildung ist. Durch die Integration aller Informationen aus Charakterisierungsexperimenten wurde verfeinerter computerunter-stützter Modellbau der Tertiärstruktur ermöglicht. Darüber hinaus konnten Hypothesen zum Faltungsweg und zum Reaktionsmechanismus formuliert werden, die als Ausgangspunkt für zukünftige, z.B. physikochemische Experimente dienen können.
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