TY  - GEN
N2  - Die circadianen Uhren eukaryontischer Organismen bestehen aus einem Netzwerk miteinander verknüpfter Rückkopplungsschleifen. Ein grundlegendes Prinzip darin ist eine negative Transkriptions-Translations-Rückkopplungsschleife, in der ein Protein die Transkription seiner eigenen mRNA zeitverzögert reprimiert. Daher spielt die Regulation der nukleocytoplasmatischen Verteilung einzelner Proteine im molekularen Mechanismus der Uhren eine wichtige Rolle. FREQUENCY (FRQ) ist eine der zentralen Komponenten der circadianen Uhr von Neurospora crassa. Es hemmt zum einen im Zellkern die Transkription seiner eigenen mRNA (negative Rückkopplung), zum anderen fördert es im Cytosol die Bildung des White Collar Komplexes (WCC) bestehend aus den Transkriptionsfaktoren White Collar (WC) 1 und 2 (positive Rückkopplung), der wiederum die Transkription von frequency-mRNA bewirkt. Die zeitliche Abfolge beider Funktionen ist exakt festgelegt, daher muss die subzelluläre Verteilung von FRQ präzise reguliert werden. Um das korrekte Funktionieren der Uhr zu gewährleisten, ist FRQ zum größten Teil im Cytosol und nur zum kleineren Teil im Zellkern lokalisiert, obwohl es ein funktionales Kernlokalisationssignal (NLS) besitzt. frq9 exprimiert durch Leserasterverschiebung ein um ca. 30% C-terminal verkürztes Protein (FRQ9), das überwiegend im Zellkern vorkommt. Der C-Terminus ist also für die unerwartete cytoplasmatische Lokalisation von FRQ verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, welche Teile des C-Terminus die FRQ-Lokalisation beeinflussen und wie die subzelluläre Verteilung bewirkt wird. Die Verteilung kann nicht einer eng umgrenzten Region (z. B. einem putativen Kernexportsignal, NES) im C-Terminus zugeschrieben werden und spiegelt sehr wahrscheinlich ein dynamisches Gleichgewicht aus Kernimport und -export wider. Ein Teil der FRQ-Population könnte durch Modifikation im Zellkern diesem shuttling-Prozess entzogen werden, so dass er nicht wieder in den Zellkern gelangen kann (z. B. durch Maskierung eines Kernlokalisationssignals, NLS). Phosphorylierungen sind ein wichtiger Regulationsmechanismus für FRQ-Funktionen und könnten auch an der Festlegung der subzellulären Lokalisation beteiligt sein. Um in vivo-Phosphorylierungsstellen und Bindungspartner von FRQ massenspektrometrisch identifizieren zu können, wurden verschiedene Affinitätschromatographiemethoden auf ihre Verwendbarkeit in N. crassa getestet. Eine einzelne Methode führte in keinem Fall zu ausreichender Anreicherung von FRQ, aber eine Doppelstrategie aus His6/Ni2+- und StrepTag II/StrepTactin-Aufreinigung erscheint viel versprechend, da beide das Protein aus Totalextrakten depletieren können und die Puffer miteinander kompatibel sind. Schließlich wird ein Satz neuer Expressionsvektoren für die Transformation von N. crassa vorgestellt. Jeder dieser Vektoren komplementiert die Histidinauxotrophie der his-3-Mutante und besitzt einen N. crassa-Promotor, einen Polylinker sowie einen Transkriptionsterminator mit Polyadenylierungsstelle. 
TI  - Subzelluläre Verteilung des zentralen Uhrenproteins FREQUENCY in der circadianen Uhr von Neurospora crassa
A1  - Heise, Felix
KW  - circadiane Uhr 
KW  -  subzelluläre LokalisationNeurospora crassa 
KW  -  circadian clock 
KW  -  subcellular localisation 
KW  -  chronobiology
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/7756/
Y1  - 2007///
ID  - heidok7756
AV  - public
ER  -