title: Establishment of in vivo bioluminescence imaging models for tumor immunology
creator: Miloud, Tewfik
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: Die Überwachung des Tumorwachstums bzw. das Verfolgen von Zellen oder Pathogenen kann anhand des bildgebenden Verfahrens der in vivo Biolumineszenz (engl. in vivo bioluminscence imaging, Abk. BLI) erfolgen. Da die Methode des BLI noch in ihren Anfängen steht, konzentrierte sich diese Arbeit auf die Auswahl der optimalen Luciferase, um diese anschließend zur Etablierung eines in vivo BLI-Modells, das Studien der Tumorimmunologie dient, zu nützen. Außerdem sollte anhand von lumineszierenden Bakterien die Visualisierung von Tumoren untersucht werden. Zuerst wurde daher die meist verwendete Luciferase, die firefly luciferase (Fluc), mit der neu zur Verfügung stehenden grünen sowie roten Luciferase (CBGr99 und CBRed) des Schnellkäfers (engl. click beetle) verglichen. Zu diesem Zweck wurden equimolare Mengen der verschiedenen Proteine, CBGr99, CBRed bzw. Fluc, mit Hilfe von Zelltransfektion exprimiert. Um eine Equimolarität zu erzielen, wurde die jeweilige Luciferase mit eGFP (engl. enhanced green fluorescent protein) koexprimiert. Dies erfolgte durch Anwendung eines neuartigen bicistronischen 2A Systems, das in einer stöchiometrischen Koexpression der entsprechenden Proteine resultiert. Durch in vitro Experimente konnte die höchste absolute Photonen Ausbeute bei CBGr99 festgestellt werden. Injektion der Transfektanten an verschiedenen Stellen einer Maus zeigtendass die click beetle Luciferasen (CBLucs) besser gelisnet als Fluc fur die BLI sind. Der Vergleich zwischen den verwendeten CBLucs ergab, dass CBGr99 eine bessere oder ähnliche in vivo Sensitivität als CBRed aufwies, die jedoch vom Zeitpunkt der Analyse abhing. Die Analyse der mit CBGr99 transfizierten Zellen zeigte, dass die CBGr99 Expression mit der Zellanzahl korrelierte und somit für das Überwachen des Tumorwachstums in vivo verwendet werden konnte. Dafür wurde eine induzierbare transgene Mauslinie genereriert, die mit Hilfe des Cre/loxP Systems CBGr99 spezifisch in Leberzellen (ASC Linie) exprimiert. Diese transgene Mauslinie wurde mit der Linie AST gekreuzt, die nach Injektion eines Cre-recombinase kodierenden Adenoviruses autochthones Hepatokarzinom Wachstum entwickelt. Der Nachwuchs dieser Kreuzung, als ASCT benannt, ermöglichte das nicht-invasive Beobachten der Entwicklung des Hepatokarzinoms in lebenden Tieren durch in vivo BLI mittels der Expression von CBGr99. Das in dieser Arbeit entwickelte ASCT-Modell kann daher zur zeitlichen Überwachung des Tumorbeginns und -fortschreitens genützt und effektiv für Analysen zur Wirkug von Therapien verwendet werden. Ein weiterer Ansatz zur Visualisierung von Tumoren ist die Verwendung von Luciferaseexprimierenden Bakterien. Viele Bakterienstämme visieren nach intravenöser Injektion speziell Tumore an (engl. tumor targeting) und können dort überleben, während sie in Geweben vernichtet werden. BLI-Messungen zeigten, dass transgene Vibrio cholerae, die ein bakterielles Luciferase Gen (luxCDABE) exprimieren, Tumore in tumortragenden, immundefizienten Mäusen besiedeln („Tumor homing“). In dieser Arbeit konnte sowohl mit V. cholerae als auch mit Top10 E.coli ein effizientes „targeting“ von subkutanen Tumoren in immunkompetenten Mäusen, die eine Immunantwort gegen Bakterien erzeugen können, erzielt werden. Es konnte vorübergehend beobachtet werden, dass in verschiedenen Tumoren, wie z.B. AG104A, B16 sowie RMA, Tumorkolonisierung stattfand. Zusätzlich wurde die Fähigkeit der Bakterien, Tumore in verschiedenen spontanen Tumormodellen anzuvisieren, untersucht, z.B. in dem Hepatom-Modell (Albumin-Tag Mäuse), dem Insulinom-Modell (RIP.Tag-5 Mäuse) oder den Mammakarzinom-Modell (Her-2/neu Mäuse). Mit Hilfe des BLI konnte das bakterielle „homing“ in diese Tiermodellen untersucht werden und zeigte, dass die Effizienz des „tumor targeting“ geringer war als in subkutanen Tumoren. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass Bakterien als Vektoren für GM-CSF und IL-2 genützt werden können, um die Abwehr von Tumoren durch das Immunsystem zu verstärken. Damit eine Sekretion von GM-CSF und IL-2 mit Hilfe des Bakterienstammes Top10.lux im Tumorgewebe ermöglicht werden konnte, wurden die entsprechenden DNA-Sequenzen in ein Hemolysin A sekretorisches System kodierendes Plasmid inseriert. Die therapeutische Vakzinierung zeigte, dass Mäuse mit subkutanen Tumoren nach intravenöser Injektion mit Top10.lux.GM-CSF keine verstärkte Verzögerung des Tumorwachstums aufweisen, was im Gegensatz dazu bei Injektion mit Top10.lux beobachtet wird. Um die Infiltration von T-Zellen in das Tumorgewebe zu analysieren, wurde zusätzlich eine transgene Mauslinie (CAG-L2ACh) generiert, die CBGr99-positive Zellen liefert. Die CAGL2ACh Linie koexprimiert CBGr99 und ein rot fluoreszierendes Protein (mCherry) unter der Kontrolle eines ubiquitären Promoters. Anhand des BLI konnte in allen Geweben eine CBGr99 Expression festgestellt werden. Jede einzelne T-Zelle exprimierte mCherry und somit CBGr99. Daher zeichnet sich die CAG-L2ACh Linie als universeller Donor für „celltrafficking“ Studien mit Hilfe der BLI-Methode aus.
date: 2007
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/7980/1/PhD_Thesis_Tewfik_Miloud.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00007980
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-79809
identifier:   Miloud, Tewfik  (2007) Establishment of in vivo bioluminescence imaging models for tumor immunology.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/7980/
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language: eng