%0 Generic
%A Anderl, Frank
%D 2008
%F heidok:8073
%K Arf1 , p24coatomer , COPI , p24
%R 10.11588/heidok.00008073
%T Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionen der kleinen GTPase Arf1 während der COPI Vesikel-Biogenese
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8073/
%X Die kleine GTPase Arf1 übernimmt eine zentrale Rolle während der COPI Vesikel- Biogenese. Im inaktiven, Arf1-GDP Zustand liegt Arf1 überwiegend als lösliches Protein im Cytosol vor. Durch Interaktionen mit Proteinen der p24 Familie wird Arf1-GDP an die Golgi-Membranen rekrutiert. Es folgt der Austausch von GDP zu GTP wodurch Arf1 eine Konformationsänderung erfährt und die Interaktion zwischen Arf1 und den p24 Proteinen aufgehoben wird. Anschließend rekrutiert Arf1-GTP zusammen mit den p24 Proteinen den Coatomer-Komplex aus dem Cytosol an die Golgi-Membran. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion der p24 Proteine als Arf1-GDP Rezeptoren näher untersucht. Mit Hilfe der SPR-Technologie (BIAcore) wurde die direkte Interaktion zwischen Arf1-GDP und allen bis heute in Säugerzellen nachgewiesenen p24 Proteinen überprüft. Hierzu wurden Peptide, die der cytoplasmatischen Domäne der p24 Proteine entsprechen, in monomerer und homo oder heterodimerer Form eingesetzt. Es konnte nachgewiesen werden, dass p24 Proteine in monomerer Form nicht an Arf1-GDP binden. Im Gegensatz dazu interagieren die Homodimere p23 und p24 sowie die Heterodimere p23/p24, p23/27 und etwas schwächer p24/p27 mit Arf1-GDP. Die SPR-Ergebnisse konnten anschließend biochemisch durch Bindungsstudien an isolierten Golgi-Membranen bestätigt werden. Desweiteren wurden alle Heterodimere auf ihre Fähigkeit zur Coatomer-Aggregation getestet. Dabei konnte gezeigt werden, dass alle p24 Proteine, die mit Arf1-GDP interagieren, auch zur Polymerisierung von Coatomer beitragen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden photolabile, myristoylierte Arf1-Derivate in vivo generiert, auf ihre Funktionalität überprüft und anschließend in Bindungsstudien eingesetzt. Hierdurch konnte zum einen die Interaktion von Arf1-GTP mit β- und γ-COP bestätigt werden. Auf Grund der höheren Mengen an erzielten Crosslinkprodukten war es möglich, diese Interaktionen näher zu analysieren. So konnte gezeigt werden, dass Arf1-GTP an beide Isoformen der γ-Untereinheit (γ1- und γ2-COP) bindet und die switch1 Region von Arf1 mit den Trunk-Domänen von β- und γ-COP wechselwirkt. Zum anderen wurde eine neue Interaktion von Arf1 mit der Coatomer-Untereinheit δ-COP gefunden. Untersuchung der Abfolge der Wechselwirkungen von Arf1 mit Coatomer führen zu einem Modell bei dem es sich bei der Rekrutierung von Coatomer durch Arf1-GTP um einen mehrstufigen Prozess handelt. Außerdem deuten die Bindungsstudien mit photolabilen Arf1-Derivaten auf eine gleichzeitige Bindung mehrerer Arf1 Moleküle an Coatomer hin und somit auf die Existenz einer oligomeren Arf1 Form.