title: Analyse der frühen Schritte der HIV-1-Zell-Interaktion mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie
creator: Lampe, Marko Norman
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: Der erste Schritt einer HIV-Infektion ist die Fusion des Virus mit der Plasmamembran der Zielzelle. Eine Blockade dieses Schritts, z.B. durch Medikamente, verhindert eine Neuinfektion von Zellen im menschlichen Organismus. Für die Entwicklung neuer Medikamente ist ein genaueres Verständnis der Fusionsreaktion erforderlich.  Die bisherigen Analysen der Fusionskinetik beruhen nahezu ausschließlich auf biochemischen und virologischen Ensemblemessungen, die nur eine vergleichsweise geringe Zeitauflösung (im Minutenbereich) ermöglichen. Außerdem bedürfen diese Experimente einer artifiziellen Synchronisation des Ablaufs (z.B. Virusbindung an die Wirtszelle bei 4°C). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Virus-Zell-Fusionsreaktion fluoreszenzmikroskopisch in Echtzeit auf Einzelpartikelebene zu beobachten und deren Kinetik zu analysieren. Dazu wurden Viruspartikel verwendet, deren Hülle und Kern mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren markiert waren (MA.eGFP und mRFP1.Vpr). Das infektiöse, reife HI-Virus besteht aus einer Lipidhülle assoziiert mit Matrixproteinen (MA) und einem inneren Kapsid, das u.a. das virale RNA-Genom und das akzessorische Protein Vpr enthält. Bei Fusion sollte sich das Matrixprotein vom verbleibenden subviralen Partikel trennen, was als Farbtrennungsereignis im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden sollte. Darüberhinaus könnte der Transport des subviralen Partikels über mRFP1.Vpr im Zytosol weiter verfolgt werden. Basierend auf dieser Strategie sollte ein experimentelles System etabliert werden, das die Beobachtung einzelner Fusionsereignisse in Echtzeit auflöst.  Die Charakterisierung der doppelt fluoreszenzmarkierten Viruspräparationen zeigte, dass die Virussuspension monodispers war und die Viruspartikel einen hydrodynamischen Durchmesser von ungefähr 170 nm besaßen. Die fluoreszenzmarkierten Viruspartikel waren zu über 90 % zweifarbig und wiesen eine um 80 % reduzierte Infektiosität im Vergleich zum Wildtyp auf. Die Fusionskompetenz war jedoch nicht beeinträchtigt. Die biochemische Analyse ergab, dass die Inkorporation von mRFP1.Vpr in die Viruspartikel die Prozessierung des Gag-Polyproteins und damit eventuell die Virusreifung leicht beeinträchtigte.  Die Beobachtung der Interaktion der fluoreszenzmarkierten Viruspartikel mit der Zellmembran von adhärenten Modellzelllinien wie HeLaP4 erfolgte durch Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Als störend für die mikroskopische Analyse erwies sich eine starke Virusanheftung an den Adhäsionsfaktor Heparansulfat auf der Zelloberfläche. Es konnte  gezeigt werden, dass der Beitrag von Heparansulfat auf die Infektiosität nur gering war. Daher wurde Heparansulfat in den folgenden Experimenten durch enzymatische Behandlung von der Zelloberfläche entfernt.  Mehr als 10.000 Trajektorien von HIV-Partikeln, die an die Wirtszelle gebunden waren oder diese berührten, wurden manuell analysiert, aber es konnte kein Farbtrennungsereignis detektiert werden. Zur verbesserten und beschleunigten Datenauswertung wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Karl Rohr (Biomedical Computer Vision Gruppe, IPMB, Universität Heidelberg) eine Tracking-Software entwickelt. Um die Wahrscheinlichkeit der Detektion eines Fusionsereignisses zu erhöhen, wurden hochfusogene VSV-G pseudotypisierte Viruspartikel eingesetzt. Im Gegensatz zur vom HIV-Hüllprotein vermittelten Fusion an der Plasmamembran fusionieren die pseudotypisierten Viruspartikel im sauren Milieu des Endosoms. Mit den VSV-G pseudotypisierten Viruspartikeln gelang es ein Farbtrennungsereignis zu detektieren, das den Erwartungen für eine Fusion entsprach. Die Analyse des Farbtrennungsereignisses ergab, dass das Partikel nach der Farbtrennung eine gerichtete Bewegung ausführte, die auf die Interaktion des potentiell subviralen Partikels mit Motorproteinen hinweist. Obwohl nur dieses eine Farbtrennungsereignis direkt mikroskopisch nachweisbar war, konnte indirekt in den Zellen eine effiziente Fusion der VSV-G pseudotypisierten Viruspartikel gezeigt werden. Die Zellen zeigten nach Inkubation mit den Viruspartikeln im Zytosol eine diffuse Färbung hervorgerufen durch MA.eGFP, während im Zellkern eine diffuse mRFP1.Vpr-Fluoreszenz zu detektieren war. Eine mögliche Ursache für die schwierige Detektion von einzelnen Fusionsereignissen könnte die experimentell nachgewiesene Stabilisierung der Viruspartikel durch inkorporiertes mRFP1.Vpr sein, die eine Trennung von Matrix und Viruskapsid beeinträchtigte. In dieser Arbeit wurden die technischen Grundlagen für eine effiziente Detektion von Virus-Zell-Interaktionen durch Etablierung der Mikroskopie- und Auswertetechnik geschaffen. Die hierfür entwickelte Tracking-Software erlaubt eine schnelle und quantitative Auswertung großer Experimentreihen. Die dazu notwendigen zweifarbig fluoreszenzmarkierten Viruspartikel wurden ausführlich charakterisiert, so dass zukünftig die Fusion auf Einzelpartikelebene mit verbesserten Systemen effizienter untersucht werden kann. 
date: 2008
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8098/1/Dissertation.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00008098
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-80985
identifier:   Lampe, Marko Norman  (2008) Analyse der frühen Schritte der HIV-1-Zell-Interaktion mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8098/
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language: ger