title: Studium der Wachstumskinetik von Intermediärfilamenten mit Hilfe von Vimentin
creator: Kirmse, Robert
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: In dieser Arbeit wurde die Wachstumskinetik der in vitro Filamentebildung des Intermediärfilamentproteins Vimentin untersucht, und versucht diese quantitativ zu beschreiben. Als Grundlage dienten bestehende qualitative Beschreibungen der Filamentbildung. Das Protein Vimentin wurde rekombinant in E. coli hergestellt und über Säulenaustauschchromatographie gereinigt und in 8 M Harnstoff- Puffer gelagert. Die Renaturierung von Vimentin vor den Versuchen erfolgte durch ein Dialyseverfahren gegen Pi-Puffer (2 mM Na-Phosphat, pH 7.5). Schon während der Dialyse bilden sich zuerst Vimentin-Dimere gefolgt von Tetrameren. Nach der Dialyse liegt Vimentin als Tetramer im Pi-Puffer vor, was mit Hilfe der analytischen Ultrazentrifuge kontrolliert wurde. Um die Wachstumskinetik zu messen wurde die Salzkonzentration im Pi-Puffer auf 100 mM KCl erhöht. Dadurch beginnen die Vimentin-Tetramere lateral zu assoziieren und es entstehen ”Unit-Length- Filamente” (ULFs) aus acht Tetrameren. Diese ULFs können dann longitudinal zu langen Filamenten zusammenwachsen. ImVerlauf des Längenwachstums findet gleichzeitig eine Kompaktierung des Filaments statt. Diese radiale Kompaktierung konnte in dieser Arbeit nochmals bestätigt werden. Das Längenwachstum per Zeiteinheit wurde zuerst mit Hilfe des Elektronen- und Rasterkraftmikroskops (EM & SFM) untersucht. Im EM wurde das Wachstum nach definierten Zeitschritten durch Zugabe von Glutaraldehyd gestoppt. Im SFM dagegen wurde die Reaktion durch Verdünnen stark verlangsamt und dasWachstum durch Adsorption an eine Oberfläche endgültig beendet. Durch Bildanalyse wurde die Längenverteilung der Filamente auf den resultierenden Bilderserien bestimmt. Zudem wurde der Einfluss der eingesetzten Oberflächen (kohlebeschichtete Kupfernetze im EM sowie Glimmer und Glas im SFM) charakterisiert und die Ergebnisse miteinander mit Hilfe statistischer Methoden verglichen. Dadurch konnte bestätigt werden, dass eine kinetische Messung des Filamentwachstums auf diese Weise möglich ist und dass die Resultate aus den EM und SFM Messungen miteinander verglichen werden dürfen. Da mit Hilfe der Mikroskope insbesondere das lateraleWachstum vom Tetramer hin zum ULF innerhalb der ersten Sekunden nicht aufgelöst werden konnte, wurde diese Phase des Filamentwachstums mit einem ”Stopped-Flow”-Gerät untersucht. Hierbei wurde das Vermischen der Reaktionslösungen mit Hilfe eines Computers gesteuert, wodurch eine Beobachtung der Reaktion nach wenigen Millisekunden möglich war. Der Verlauf der Reaktion wurde mit Hilfe von Laserlichtstreuung gemessen. Zusätzlich wurden verschiedene kinetische Modelle auf Grundlage der bestehenden qualitativen Betrachtungen zum Filamentwachstum entwickelt. Aus diesen Modellen wurde ein Modell ermittelt, das die Messdaten am besten beschreibt. Durch mathematische Anpassung dieses Modells konnte dann eine erste qualitative Beschreibung derWachstumskinetik von Vimentin vorgeschlagen werden, die quantitativen Daten optimal wiedergibt. So konnte an dieser Stelle bestätigt werden, dass ULFs tatsächlich zum Filamentwachstum beitragen müssen und längere Filamente durch End-zu-End Fusion zusammenwachsen. Damit konnte im Rahmen dieser Arbeit eine, im Gegensatz zur Polymerisation von Aktin und Tubulin, neue Form des Filamentwachstums beschrieben werden, bei dem das Wachstum zuerst durch eine laterale Assoziation mit anschließender longitudinalen Verlängerung gekennzeichnet ist.
date: 2007
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8341/1/Kirmse.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00008341
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-83413
identifier:   Kirmse, Robert  (2007) Studium der Wachstumskinetik von Intermediärfilamenten mit Hilfe von Vimentin.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8341/
rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
rights: http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/help/license_urhg.html
language: ger