TY  - GEN
AV  - public
Y1  - 2008///
TI  - Fluoreszenzgelöschte Sonden für diagnostische und analytische Anwendungen
KW  - SNAP-tag 
KW  -  Proteinmarkierung 
KW  -  Smart ProbeSNAP-tag 
KW  -  protein labeling 
KW  -  Smart Probe
ID  - heidok8373
A1  - Stöhr, Katharina Anna
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8373/
N2  - Ziel der hier vorliegenden Arbeit war die Entwicklung fluoreszenzgelöschter Sonden, welche auf der Fluoreszenzlöschung durch photoinduzierten Elektronentransfer basieren. Es wurden zwei molekulare Sonden weiterentwickelt, die durch Guanin gelöscht werden. Einerseits wurden (i) SMART PROBES zur schnellen und spezifischen Identifizierung verschiedener Mykobakterienspezies eingesetzt. Darüber hinaus konnten (ii) SNAP-TAGS zur selektiven Markierung von Proteinen in Säugerzellen und Bakterien angewendet werden. Die der Arbeit zugrunde liegende Idee war es, eine gesteigerte Sensitivität dieser Methoden durch gezielte Fluoreszenzlöschung und damit einhergehend eine Reduzierung von unspezifischer Hintergrundfluoreszenz zu erreichen. Die spezies-spezifische, sensitive, zuverlässige und kostengünstige Identifizierung bestimmter DNA-Sequenzen als Instrument der Diagnostik bakterieller Erreger ist aufgrund unterschiedlicher Behandlungsstrategien sowie des stetigen Auftretens neuartiger Erreger von großer Bedeutung für die Routinediagnostik.  Eine besondere Herausforderung stellt hierbei das Genus Mycobacterium mit seinen aktuell mehr als 100 valide beschriebenen Arten dar. Die Identifizierung sowie die exakte Differenzierung dieser Erreger sind vor allem aufgrund des zumeist sehr langsamen Wachstums der Mykobakterien von zwölf bis 20 Stunden erschwert. Ein schnelles und kostengünstiges Verfahren ist daher dringend erforderlich. Traditionelle, auf biochemischen Merkmalen gründende Identifikationssysteme werden dabei in den letzten Jahren immer mehr von molekularbiologischen Verfahren abgelöst.  Eines dieser neuen Verfahren basiert auf dem Einsatz von SMART PROBES. Sie können in einem neuen, hochempfindlichen DNA-Nachweisverfahren zur Früherkennung antibiotikaresistenter Erreger eingesetzt werden. SMART PROBES sind DNA-Haarnadelsonden, welche durch konformative Änderung der Struktur entweder im fluoreszenzgelöschten oder im fluoreszierenden Zustand vorliegen. Diese Sonden wurden am Physikalisch-Chemischen Institut der Universität Heidelberg entwickelt. Die räumliche Nähe des Farbstoffs zu mehreren Guanosin-Nukleobasen in der Stamm-Schleife-Struktur führt zu einer Löschung des Fluorophors. Bei Zugabe von Gegensequenz öffnet sich die SMART PROBE, was eine lokale Trennung von Farbstoff und Guanosin bewirkt, woraus ein messbarer Fluoreszenzanstieg resultiert. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit SNAP-TAGS. Diese stellen eine neue Methode zum kovalenten Markieren von Fusionsproteinen mit synthetischen Farbstoffen sowohl für in vitro wie auch für Anwendungen in lebenden Zellen dar. Herkömmliche Methoden zur Fluoreszenzmarkierung von Proteinen greifen auf reaktive Farbstoffe oder autofluoreszierende Proteine zurück. Diese Methoden sind jedoch beschränkt durch die fehlende Selektivität beziehungsweise durch die Größe (Green Fluorescent Protein (GFP) ~ 27 kDa) der fluoreszierenden Proteine, welche oftmals der Größe des zu untersuchenden Proteins entsprechen. Des Weiteren weisen autofluoreszierende Proteine oft eine komplizierte Photophysik sowie eine geringe Photostabilität auf. Invasive Methoden, welche organische Fluorophore durch Elektroporation, Mikroinjektion oder Endozytose in die Zelle schleusen, schädigen die Zelle, wodurch ihre Funktionalität oft nicht mehr gewährleistet ist.  Die SNAP-TAG Markierung bietet hier eine nicht invasive Alternative. Sie basiert auf dem irreversiblen Transfer der Benzylgruppe von O6-Benzylguanin (O6-BG) auf das DNA-Reparaturprotein O6-Alkylguanin-DNA Alkyltransferase (AGT). Dieses Protein besitzt spezifische Aktivität für O6-BG-Derivate, die zum kovalenten Markieren von AGT-Fusionsproteinen in vitro und in lebenden Zellen eingesetzt werden. Um das Potenzial der AGT-Markierung zu testen, wurden in dieser Arbeit 30 BG-Farbstoffsubstrate synthetisiert, welche den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich abdeckten. Die BG-Substrate wurden zunächst hinsichtlich ihre photophysikalischen Eigenschaften, Lebensdauer und relativen Quantenausbeute untersucht. Hierbei konnten neun fluoreszenzgelöschte Substrate ermittelt werden, welche den Wellenlängenbereich von 425 nm bis 700 nm abdecken. Um den Fluoreszenzanstieg nach der Markierung von AGT zu ermitteln, wurden die Substrate mit isoliertem hAGT in in vitro Experimenten eingesetzt. Für die Anwendung der AGT-Markierung in lebenden Zellen wurden zum einen AGT-Fusionsprotein exprimierende Escheria coli eingesetzt, zum anderen AGT-defiziente CHO-Zellen (Chinesische Hamster Ovarien), welche mit Expressionsvektoren transfiziert waren, die das Gen eines AGT-Fusionsproteins enthielten. Bei letzteren war das Fusionsprotein im Nukleus lokalisiert. 
ER  -