%0 Generic
%A Pfander, Stephanie
%D 2008
%F heidok:8383
%K In vitro Selektion , katalytische Triaderibozyme , in vitro selection , proteolytic activity , peptide nucleic acid , catalytic triad
%R 10.11588/heidok.00008383
%T In vitro Selektion von Ribozymen mit Proteaseaktivität
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8383/
%X Ribonukleinsäuren (RNA) gehören zu den faszinierendsten und spannendsten Biopolymeren der aktuellen Forschung. Ihre mannigfaltigen Funktionen sind für eine Vielzahl von biochemischen Prozessen von essentieller Bedeutung. Zu den bekanntesten Aufgaben der RNA gehört die Umsetzung genetischer Information in Proteine. Dabei ist RNA neben der Eigenschaft als Informationsträger auch aktiver Katalysator für die Knüpfung der Peptidbindung im Ribosom. Die funktionelle Vielfältigkeit von RNA wurde in den letzten Jahren durch die Erforschung der Genregulation mittels RNA-Interferenz bedeutend erweitert; deren Beteiligung an verschiedenen zellulären Mechanismen und Krankheiten wird aktuell intensiv erforscht. Die Entdeckung katalytisch aktiver RNA Sequenzen, so genannter Ribozyme, war ein weiterer Meilenstein in der Erforschung des multifunktionellen Potentials von RNA. Das zunächst durch die Natur eingeschränkte Katalysespektrum von Reaktionen an Phosphodiestern konnte durch die Anwendung der in vitro Selektion oder SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)und die dadurch mögliche Entdeckung neuer künstlicher Ribozyme um ein Vielfaches erweitert werden. Diese Erkenntnisse über die vielfältigen Funktionen von Ribonukleinsäuren stützen die Hypothese einer RNA-Welt, wobei das entsprechende Ribozym für jede hierfür essentielle Reaktion noch nicht gefunden werden konnte. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Erweiterung des Repertoires katalytisch aktiver RNA-Spezies durch die Selektion von Ribozymen mit proteolytischer Aktivität. Aufgrund der hohen Stabilität der Peptidbindung stellte dies eine besondere Herausforderung dar. Um das Repertoire an funktionellen Gruppen, die der RNA zur Verfügung stehen, zu erweitern und eine Peptidspaltung in Analogie zu Serinproteasen zu ermöglichen, wurde ein neuartiger Cofaktor entwickelt und hergestellt, der zwei unterschiedliche funktionelle Einheiten miteinander verbindet. Zum einen wurde eine katalytische Triade integriert, deren Aminosäuren Serin, Histidin und Aspartat durch kurze Linker miteinander verbunden sind. Zum anderen ermöglicht eine kurze PNA- (Peptide Nucleic Acid) Sequenz eine Verankerung der Triade an der RNA-Bibliothek und bringt dadurch Cofaktor und Katalysator in räumliche Nähe zueinander. Zur Realisierung dieses Projekts wurde der verbesserte Ansatz der direkten in vitro Selektion mit linkergekoppelten Substraten gewählt und hierfür ein geeignetes Selektionsschema konzipiert. Die einzelnen Selektionsschritte konnten durch Vorversuche etabliert werden. Dies beinhaltete zunächst die Synthese multifunktioneller Peptidsubstrate, die neben zwei unterschiedlichen Affinitätsmarkern auch inerte Linker und eine geeignete funktionelle Gruppe für die kovalente Verknüpfung mit der RNA-Bibliothek enthielten. Als nächster Schritt erfolgte die Optimierung der Konjugation von Peptidsubstrat und RNABibliothek. Hierfür wurde ein Protokoll gewählt, das mit RNA-Molekülen, die durch in vitro Transkription gewonnen werden, kompatibel ist und in dieser Arbeit durch die Anwendung eines neu synthetisierten Initiatornukleotids realisiert wurde. Die auf diese Weise generierte Bibliothek von RNA-Peptid-Konjugaten diente als Ausgangspunkt eines jeden Selektionszyklus, der nach Transkription und Konjugation durch eine doppelte Immobilisierung, zunächst der inaktiven und anschließend der aktiven Sequenzen, sowie der spezifischen Anreicherung aktiver Moleküle durch Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion komplettiert wurde. Eine erste durchgeführte Testselektion über 10 Runden und anschließende Analytik des minimal angereicherten RNA-Pools ermöglichten eine Konkretisierung potentieller Fehlerquellen, sowie die weitere Optimierung der einzelnen Selektionsschritte. Das in dieser Arbeit etablierte Selektionsschema bietet nun eine exzellente Ausgangsposition für die Durchführung einer in vitro Selektion für die Generierung von Ribozymen mit Proteaseaktivität.