%0 Generic
%A Kiel, Alexander
%D 2008
%F heidok:8544
%K Metallkomplex , Kinetik , Fluoreszenzlöschung , Kupfer(II)bipyridin , Metallionensensormetal complex , kinetic , single molecule spectroscopy , fluorescence quenching , metal ion sensor
%R 10.11588/heidok.00008544
%T Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie zur Untersuchung von Metallkomplex-Reaktionen im thermodynamischen Gleichgewicht
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8544/
%X Die Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie wurde in den letzten Jahren erfolgreich zur Untersuchung biologischer Fragestellungen eingesetzt. Dynamische Wechselwirkungen kleiner Biomoleküle, wie z.B. DNS, RNS, Proteine oder enzymkatalytischer Reaktionen, konnten beobachtet werden. Aufbauend auf diesen Verfahren konnte in dieser Arbeit die Grundlage zur Untersuchung heterogener oder homogener katalytischer Reaktionen einfacherer organischer oder anorganischer Systeme geschaffen werden. Dazu wurde eine Fluoreszenzsonde entwickelt, deren Fluoreszenz durch Cu(II)-Ionen gelöscht wird. Die Sonde besteht aus einem DNS-Doppelstrang, welcher als starres Gerüst dient, und endständig mit einem Cu(II)-spezifischen Liganden 4,4’-Dicarboxy-2,2’-bipyridin (dcbpy) sowie einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Um einen geeigneten Fluoreszenzmarker zu finden, wurde eine Reihe Farbstoffe bezüglich ihrer Fluoreszenzlöschung durch Cu(II) charakterisiert. Als besonders geeignet wurden die Farbstoffe Tetramethylrhodamin (TMR), Atto620, MR121 und Atto635 ausgewählt und die Sonde damit markiert, eine bis zu 92-prozentige Fluoreszenzlöschung nach Bindung von Cu(II) am Liganden konnte beobachtet werden. Zur Untersuchung, ob die Ligand-Modifikation ursächlich für die verstärkte Löschung durch Cu(II) ist, wurden Kontrollmessungen mit einer Sonde ohne dcbpy-Modifikation durchgeführt. Mit Ausnahme der Atto635-markierten Sonde konnte bei allen Sonden eine verstärkte Löschung durch den dcbpy-Liganden beobachtet werden. Die beste Unterscheidbarkeit zwischen Ligand-markierter- und Kontrollsonde ergaben die Farbstoffe Atto620 und TMR. Zur quantitativen Bestimmung der Komplexgleichgewichtskonstante aus der Fluoreszenzlöschung wurde die Stern-Volmer Theorie auf die hier entwickelten Sonden angepasst, so dass eine Restfluoreszenz im gelöschten Zustand berücksichtigt werden konnte, und der experimentelle Kurvenverlauf erklärt werden konnte. Die Anpassung der Modellparameter erlaubt die Bestimmung der Gleichgewichtskonstante der Komplexbildung K, sowie der relativen Quantenausbeute des gelöschten Zustands Aus. Für die mit Atto620 markierte Sonde wurde K zu 5,9 ∙ 106 M-1 und Aus zu 35 % bestimmt, für die mit TMR markierte Sonde ergab sich K zu 8,5 ∙ 106 M-1 mit Aus = 8 %.  Die Spezifität der Sonden wurde mit Löschexperimente in Gegenwart von Mn(II), Fe(II), Ni(II), und Co(II) an der TMR-markierten Sonde untersucht und mit dem modifizierten Stern-Volmer Modell ausgewertet. Mit Ausnahme von Ni(II), das eine relative Quantenausbeute im gelöschten Zustand Aus von 22 % zeigte, stören diese Ionen mit Aus von > 55 % die Messung von Cu(II) kaum. Mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie wurde die Fluoreszenzlöschung durch Komplexbildung der TMR- und der Atto620-markierten Sonde mit Cu(II) untersucht. Dazu wurde die Sonde auf einer Glasoberfläche immobilisiert und die Fluoreszenz einzelner Sonden nacheinander mit einem konfokalen Mikroskop aufgezeichnet. Dies ermöglichte erstmals die direkte Beobachtung aufeinander folgender Assoziations- und Dissoziationsereignisse. Die Ereignisse sind als Sprünge zwischen zwei Fluoreszenzintensitätsstufen erkennbar, d.h. die Sonde wechselte durch Bindung von Kupfer(II) von einem stark fluoreszierenden An-Zustand in einen schwach fluoreszierenden Aus-Zustand. Dieses Verhalten wurde sowohl bei der TMR-Sonde als auch der Atto620-Sonde beobachtet, wobei sich die Fluoreszenzrate bei der TMR-Sonde um ~90 % verringerte und bei der Atto620-Sonde um ~66 %, in sehr guter Übereinstimmung mit den Ensemble-Messungen. Zur quantitativen Bestimmung der Assoziations- bzw. Dissoziationsraten wurde die Dauer dieser einzelnen Zustände mit Hilfe der Schwellwertanalyse ermittelt und schließlich aus der Häufigkeitsverteilung die Reaktionsraten bestimmt. Zur Verbesserung der Zeitauflösung wurden weitere Analysemethoden angewendet: die Autokorrelation des Fluoreszenzsignals sowie ein computergestützter Algorithmus auf Basis eines „Hidden Markov“ Modells (HMM). Beide Methoden zeigten eine weitere schnellere Kinetik mit An- und Aus-Zeiten von wenigen Millisekunden die in unregelmäßigen Abständen auftrat. Mit der auf HMM-basierten Methode konnten unter Vorgabe eines Drei-Zustandsmodells die kinetischen Parameter der Komplexbildung sowie die der schnellen Fluktuationen bestimmt werden. Die Aufklärung der Ursache dieser schnellen Fluktuationen sind Bestandteil weiterer Experimente.  In dieser Arbeit wurden zwei Hauptgebiete realisiert: die Entwicklung einer Fluoreszenzsonde zur Untersuchung einfacher chemischer Reaktionen an einzelnen Molekülen, was der Ausgangspunkt für die Untersuchung komplexerer Systeme, wie z.B. Metallkomplex-katalysierte Reaktionen, darstellt. Mit der Entwicklung und Automatisierung von Methoden zur Auswertung zeitlich fluktuierender Fluoreszenzintensitäten wurde die Grundlage zur Bestimmung von Kinetiken mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie gelegt. Dies ermöglichte die Bestimmung der Reaktionskinetik der Komplexbildung von Cu(II) mit einem Bipyridinderivat im thermodynamischen Gleichgewicht.