TY  - GEN
Y1  - 2008///
ID  - heidok8831
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/8831/
N2  - In der vorliegenden Arbeit lag der Fokus auf der Identifikation von Substraten und Interaktionspartnern der in die DNA-Schadensantwort eingebundenen Serin/Threonin Kinase Chk1. Chk1 reguliert in eukaryotischen Organismen die Transition der Zelle in verschiedene Zellzyklusphasen durch Phosphorylierung. Auf Grund dessen eignete sich besonders die proteinbiochemische Methode KESTREL zur Substratfindung, bei der Lysate chromatographisch aufgetrennt und in einer anschließenden Kinasereaktion eingesetzt werden. Größtes Problem war die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, insbesondere der Signale nach gelelektrophoretischer Auftrennung der Kinasereaktionen. Auf Grund der in dieser Arbeit ausführlich dargelegten Probleme in der Reproduzierbarkeit, wurde der KESTREL-Assay zur Substratidentifikation eingestellt und ein neuer molekularbiologischer Ansatz (Hefe-2-Hybrid) zur Identifikation von Interaktionspartnern von Chk1 begonnen. Im Rahmen der Diplomarbeit von Friederike Krop konnte mit Hilfe der in dieser Arbeit hergestellten chromatographischen Fraktionen, ein Substrat der Tyrosinkinase Pyk2 identifiziert werden (MAT2A Methionine Adenosyltransferase II, alpha; Krop, 2005). Dies deutet auf ein Chk1 spezifisches Problem im KESTREL Assay hin. Die Suche nach Interaktionspartner mittels des Hefe-2-Hybrid Systems führte zur Identifikation der N-Methylpurine-DNA-Glykosylase als potentieller Interaktions-partner der Chk1 Kinase. Diese Interaktion konnte biochemisch durch Bindungsexperimente an Glutathionagarose bestätigt werden. Weiterführende Versuche zeigten sowohl eine Co-Elution in chromatographischen Fraktionen, als auch eine Co-Lokalisation des MPG und Chk1 Proteins im Zellkern nach Co-Transfektion in der Immunfluoreszenz. Erste Daten deuteten darauf hin, dass sich die Lokalisation von MPG nach Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Cisplatin ändert. Die Interaktion wurde somit mit zwei voneinander unabhängigen Methoden nachgewiesen. Diese Experimente lieferten erste Hinweise auf eine Beteiligung der N-Methylpurine-DNA-Glykosylase in die Regulation der Chk1 vermittelten DNA-Schadensantwort.
A1  - Schadel, Vanessa
KW  - Chk1 
KW  -  N-Methylpurine-DNA-Glykosylase 
KW  -  SignaltransduktionChk1 
KW  -  N-Methylpurine-DNA-Glycosylase 
KW  -  Signaltransduction
AV  - public
TI  - Identifikation neuer Komponenten der Chk1 vermittelten Signaltransduktion
ER  -