title: Herstellung und Anwendung von hochkomplexen Peptidbibliotheken
creator: Block, Ines
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
description: Die Fähigkeit von Proteinen physische Interaktionen mit anderen Proteinen und Biomolekülen einzugehen bildet eine wichtige Grundlage ihrer Funktion im menschlichen Organismus. Störungen in diesen Interaktionen können Fehlfunktionen in den beteiligten Signal- oder Stoffwechselwegen hervorrufen und letztlich zu Krankheit und Tod führen. Für das molekulare Verständnis der beteiligten Prozesse ist es wichtig, die Protein-Interaktionen im Detail zu studieren. Neben genetischen, zellbiologischen und komplexen biochemischen Ansätzen gewinnen Array-basierte Verfahren zur systematischen Suche nach Protein-Interaktionspartnern zunehmend an Bedeutung. Die Nutzung von entsprechenden Protein- und Peptid-Arrays wird derzeit aber noch durch deren schlechte Verfügbarkeit erschwert. Peptidarrays, die sich hervorragend für die Hochdurchsatzsuche nach Agonisten und Antagonisten und somit für die Entwicklung von peptidischen Wirkstoffen eignen, werden bis dato kommerziell nach dem etablierten SPOT-Verfahren mit Arraydichten von 25 Peptiden pro cm2 gefertigt. Um die Komplexität der Peptidarrays zu steigern und die hohen Kosten der Peptidsynthese zu senken, wurde in der Arbeitsgruppe Chipbasierte Peptidbibliotheken (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg/Deutschland) eine neue Synthesetechnik entwickelt. Dieses Verfahren beruht auf Aminosäurepartikeln, in deren Matrix die Aminosäuren für die kombinatorische Peptidsynthese eingebettet sind. Die Partikel werden mit einem modifizierten Laserdrucker oder durch Einsatz von speziellen Mikrochips an die Syntheseorte auf dem Array gebracht. Anschließend wird der Träger erhitzt, wodurch sich die Partikelmatrix verflüssigt und die Kopplung der Aminosäuren an den Träger initiiert wird. Durch wiederholtes Ablagern, Koppeln und Waschen können die gewünschten Peptidbibliotheken kombinatorisch erzeugt werden. Die Methode übertrifft den Stand der Technik bezüglich ihrer Komplexität mit bis zu 400 Peptidspots/cm2 für den Laserdrucker und mit 10.000 - 40.000 Peptidspots/cm2 für den Mikrochip um ein Vielfaches und das bei deutlich geringeren Herstellungskosten.  Vor der Etablierung der Synthesemethode und der breiten Nutzung der „gedruckten“ Peptidarrays sollten diese zunächst im Rahmen meiner Arbeit umfassend charakterisiert werden. In biologischen, medizinischen und biotechnologischen Modellanwendungen sollte zudem die Verwendung der Peptidarrays als funktionelles Werkzeug getestet werden. In Phosphorylierungsexperimenten wurden Substratpeptide unterschiedlicher Kinasen, darunter die cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) und c-Src, kombinatorisch synthetisiert und auf dem Array phosphoryliert. In Übereinstimmung mit der Literatur wurde durch die PKA primär die Serin-Seitenkette phosphoryliert, wenn diese in der Erkennungssequenz RRXS (X = variable Aminosäure) vorlag. Durch diesen Versuch wurde die Anwendbarkeit der mit Hilfe von festen Aminosäurepartikeln synthetisierten Peptidarrays zur Identifizierung von spezifischen Proteinkinasesubstraten belegt. Die Experimente zur Suche nach katalytisch aktiven Peptiden beruhten auf Studien von Berkessel et al. die komplexbildende Peptide und Peptidderivate identifiziert hatten, welche die hydrolytische Spaltung von Phosphorsäureestern katalysieren. Trotz umfangreicher Versuche konnten diese Ergebnisse allerdings nicht auf die von uns synthetisierten Peptidarrays übertragen werden. Die durch die hydrolytische Spaltung entstehenden gefärbten Reaktionsprodukte konnten nicht eindeutig nachgewiesen und damit eine katalytische Aktivität der metallhaltigen Peptidderivate nicht belegt werden. In einem weiteren Modellversuch wurde nach metallbindenden Peptiden gesucht, die bspw. in der Nuklearmedizin eingesetzt werden können. Viele Radiopharmazeutika enthalten das metastabile 99mTechnetium, das als metallorganischer Komplex an ein bioaktives Molekül zur Erkennung einer Zielstruktur gebunden ist. Um [99mTc(H2O)3(CO)3]+-bindende Peptide zu identifizieren, wurde ein Hexapeptid-Array mit 133.224 individuellen Peptidspots (XAs1As2As3As4X; X= Aminosäuregemisch) auf einer chemisch modifizierten Glasplatte (21 x 22 cm2) unter Verwendung des Peptidlaserdruckers hergestellt. Die Peptidbibliothek wurde nach [99mTc(H2O)3(CO)3]+- und - als Kontrolle - nach 99mTcO3+-bindenden Peptiden durchsucht. Mit der Einschränkung, dass in der ersten und letzten Position der identifizierten Hexapeptide noch ein Gemisch von Aminosäuren vorliegt und eine abschließende Verifizierung der Resultate (z.B. HPLC) noch aussteht, wurden Peptidkandidaten bestimmt, die den Technetiumcarbonylkomplex stabil binden. Die Untersuchungen unterstreichen das Potential der „gedruckten“ Peptidarrays als Werkzeug zur Identifizierung von medizinisch relevanten Metall-Peptid- Komplexen. In einem weiteren Projekt wurde die grundsätzliche Realisierbarkeit der kombinatorischen Peptidsynthese auf einem Mikrochip anhand einfacher immunologischer Anwendungen dokumentiert. 
date: 2009
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/9234/1/Dissertation_Ines_2009.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00009234
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-opus-92344
identifier:   Block, Ines  (2009) Herstellung und Anwendung von hochkomplexen Peptidbibliotheken.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/9234/
rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
rights: http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/help/license_urhg.html
language: ger