%0 Generic
%A Walczak, Steffen
%D 2009
%F heidok:9586
%K Reportergen-Testsystem , yEGFP , Liquid Handling SystemReporter gene test system , Liquid Handling System
%R 10.11588/heidok.00009586
%T Erweiterung und Automatisierung eines hefebasierten Reportergen-Testsystems zur Detektion toxischer Potentiale
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/9586/
%X Thema der vorliegenden Arbeit ist die Erweiterung und Automatisierung eines hefebasierten Reportergen-Testsystems zur Detektion toxischer Wirkungen. Die breite Erfassung biologischer und toxischer Wirkungen von Substanzen ist eine wichtige Aufgabe bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Neben der Bestätigung vorhergesagter Wirkmechanismen ist hier vor allem die Abschätzung des toxischen Potentials von zentraler Bedeutung, um mögliche Risiken erfassen zu können. Bereits in frühen Phasen der Wirkstoffentwicklung werden daher biologische Testverfahren benötigt, die mit geringen Kosten im Hochdurchsatz gefahren werden können. Diese müssen zuverlässige Ergebnisse liefern und sollten einen Rückschluß auf mögliche Wirkungen am Menschen ermöglichen,und den Ergebnissen von humanen Zellkulturuntersuchungen entsprechen.  Ein solches Testsystem zur Detektion toxischer Potentiale im 96-well-Microplattenformat stellt das im Jahr 2000 von Afanassiev und Kollegen vorgestellte hefebasierte Reportergen-Testsystem dar. Auf Grund der Auswahl der Promotoren für das Reportergen-Plasmid von Genen, die durch DNA-Schäden induziert werden, ist dieses spezifisch für die Detektion genotoxischer Wirkungen geeignet. Um ein umfassenderes Bild der zellulären Wirkungen von Substanzen aufzuzeigen, wurden im Rahmen der Arbeit weitere Teststämme mit Promotoren anderer Spezifizität entwickelt. Eine weitere zentrale Aufgabe war die Etablierung und Optimierung des Testsystems auf einem Liquid-Handling-System zur automatisierten Durchführung von Substanztests im Hochdurchsatz. Ein erster Schritt für die Erweiterung des Testsystems war eine Umstellung vom 96-well-Microplatten-Format des bestehenden Tests auf das 384-well-Microplatten-Format. Dadurch konnten die für die Analyse erforderlichen Volumina um 60% reduziert werden, die erforderlichen Substanzmengen reduziert und die Anzahl der parallelen Messungen signifikant erhöht werden, bei gleichzeitiger Verringerung der Kosten um ca. 70%. Für die Etablierung neuer Reportergenkonstrukte und Teststämme wurden neue Gene / Promotoren zur Erweiterung des Testsystems durch Datenbank- und Literaturrecherche gesucht. Die Promotoren der ausgewählten Gene wurden mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und durch molekulares Klonieren die entsprechenden Reportergen-Plasmide hergestellt. Diese wurden für die Transformation von Hefezellen (S. cerevisiae, FF18984) zur Herstellung von Reportergenstämmen genutzt. Ausgewählte Klone wurden mit Standardsubstanzen getestet und als Reportergenstämme für weitere Untersuchungen genutzt. Um dem wachsenden Umfang des Testsystems gerecht zu werden, wurde für Durchführung der experimentellen Untersuchungen die Nutzung eines Liquid-Handling-System notwendig. Dadurch konnte ein hoher Probendurchsatz bei großer Reproduzierbarkeit erreicht werden. Mit dem erweiterten hefebasierten Reportergen-Testsystem können Muster für die Proliferationshemmung und Promotor-Induktion der untersuchten Substanzen erstellt werden.Durch den Vergleich dieser Muster kann von Substanzen mit bekanntem, toxischem Potential auf das toxische Potential bislang nicht charakterisierter Substanzen geschlossen werden.In ersten Substanztests mit Standardsubstanzen, deren toxisches Potential weitgehend bekannt ist, und Organo-Metallkomplexen (ein Rhodium-Komplex und drei verschiedene Iridium-Komplexe) wurden erste Proliferationshemmungsmuster und Promotor-Induktionsmuster erstellt. Diese wurden genutzt, um das toxische Potential dieser bislang nicht weiter charakterisierten Substanzen im Vergleich mit den bekannten Referenzsubstanzen abzuschätzen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß Kombinationen von Reportergenkonstrukten genutzt werden können, um mit vergleichsweise einfachen Experimenten Muster der zellulären Wirkungen von Substanzen zu erhalten, die eine (erste)Abschätzung toxischer Wirkungen von Substanzen ermöglichen.