%0 Generic
%A Fischer, Marcel
%D 2009
%F heidok:9644
%K Ist2 , Membranprotein , ER Subdomänen , Lipide , PtdIns(4,5)P2Ist2 , membrane protein , ER subdomains , lipid binding , PtdIns(4,5)P2
%R 10.11588/heidok.00009644
%T Lipids as Trans Acting Factors for the Transport of Integral Membrane Proteins
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/9644/
%X Ist2 ist ein integrales, polytopisches Membranprotein in Saccharomyces cerevisiae. Ein Teil der IST2 mRNA wird zur Spitze der Tochterzelle transportiert, wo das Protein lokal am kortikalen endoplasmatischen Retikulum (ER) translatiert wird. Nach der Translation in Mutterzellen akkumuliert Ist2 sehr schnell in Domänen des kortikalen ERs. Für diese kortikale Lokalisation ist ein Protein-Signal ausreichend, das sich in den letzten 69 Aminosäuren des cytosolisch orientierten C-Terminus von Ist2 befindet (kortikales Sortierungssignal von Ist2, CSSIst2). Vor allem hydrophobe und basische Aminosäuren, die eine amphipathische Helix bilden, sind von Bedeutung für den Transport von Ist2. Das CSSIst2 wirkt als dominantes Signal über andere Proteinsortierungssignale, so kann es verschiedene Golgi- und ERMembranproteine effizient in Domänen des kortikalen ERs umleiten. Die Lokalisation von Ist2 im kortikalen ER ist unabhängig von einem funktionellen sekretorischen Weg (sec). Ist2 ist zugänglich für Proteasen, die zu intakten Hefezellen zugegeben werden. Daher wurde für Ist2 ein sec-unabhängiger Transportweg von Domänen des kortikalen ERs zur Plasmamembran (PM) vorgeschlagen. Das Ziel dieser Doktorarbeit bestand in der Aufklärung des molekularen Mechanismus, der für den effizienten Transport von Ist2 zum kortikalen ER verantwortlich ist. Ich konnte zeigen, dass das lösliche CSSIst2 in vivo an die Hefe-PM bindet. Diese Membranbindung konnte als eine Interaktion des CSSIst2 mit Lipiden der PM identifiziert werden. Durch in vitro-Versuche mit Liposomen definierter Zusammensetzung konnte ich Phosphatidylinositolphosphate (PIPs) als die Lipidklasse identifizieren, die die stärkste Interaktion mit CSSIst2 aufweist. Diese Protein-Lipid-Interaktion hängt von basischen Resten des CSSIst2, sowie dessen Multimerisierung ab. Das an der PM am stärksten angereicherte PIP ist Phosphatidylinositol[4,5]-bisphosphat (PtdIns[4,5]P2). Daher ersetzte ich das kortikale Sortierungssignal von Ist2 durch eine charakterisierte PtdIns[4,5]P2-Bindungsdomäne aus Phospholipase C-δ1. Das chimäre Protein lokalisiert unter allen getesteten Bedingungen wie Wildtyp-Ist2 und komplementiert durch das Reagenz Calcofluor weiß hervorgerufene Zellwanddefekte von ist2-knockout-Stämmen. Diese Daten zeigen, dass für den Transport von Ist2 zum kortikalen ER die Bindung von Lipiden der PM notwendig und ausreichend ist. Nach der Translation von Ist2 dient das CSSIst2 als Lipid-Bindungsdomäne, die das Protein effizient an Kontakten zwischen ER und PM verankert. Fusionsproteine aus verschiedenen Golgi- und ER-Membranproteinen und der PtdIns[4,5]P2- Bindungsdomäne aus Phospholipase C-δ1 werden effizient in das kortikale ER umgeleitet. Dieser neu entdeckte Sortierungsmechanismus für integrale Membranproteine ist dominant über Signale für den Export von Proteinen aus dem ER und dominant über den proteasomalen Abbau instabiler ER-Proteine, was die Effizienz der Proteinsortierung durch Protein-Lipid- Interaktionen aufzeigt.