TY  - GEN
ID  - heidok9658
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/9658/
N2  - Der Transport von Molekülen durch die Zellmembran stellt für die Entwicklung von intrazellulär aktiven Therapeutika eine große technische Herausforderung dar. Moleküle, z. B. Proteine, die aufgrund ihrer biophysikalischen Eigenschaften per se nicht in der Lage sind die Zellmembran zu durchdringen, können diese Fähigkeit durch ihre Kopplung an Proteintransduktionsdomänen (PTDs) erlangen. Die Fusion von PTDs kann jedoch zu reduzierten Ausbeuten während der Produktion und Reinigung, sowie zu veränderten biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen führen. Daher wurden zwei neue Transportersysteme entwickelt, um nicht-modifizierte sowie modifizierte Moleküle durch die Zellmembran zu schleusen.   Das erste Modellsystem wurde generiert, um Bindungsproteine einzuschleusen, die intrazelluläre Zielmoleküle spezifisch sequestrieren können. Als Modell für ein solches Bindungsprotein diente Streptavidin (SA), das mit Hilfe einer an den SA-Bindungsliganden Strep-tag II gekoppelten PTD in Säugerzellen eingeschleust wurde. Im Zytoplasma wurde der PTD-Strep-tag II-Ligand durch Biotin ersetzt, das im Vergleich zu Strep-tag II eine höhere Affinität für die SA-Bindetasche besitzt. Der erfolgreiche Austausch von PTD-Strep-tag II durch Biotin wurde durch Bestimmung der thermischen Tetramerstabilität von SA nachgewiesen, die nach Bindung von Biotin ansteigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass es prinzipiell möglich ist, intrazelluläre Moleküle spezifisch zu sequestrieren, die eine höhere Affinität zum Bindungsprotein aufweisen als der für die Internalisierung benutzte Ligand. Unter therapeutischen Gesichtspunkten ist es vorstellbar, entsprechende Systeme für die intrazelluläre Sequestrierung und funktionelle Inaktivierung pathologisch relevanter Faktoren einzusetzen. Ein zweites Transportsystem wurde entwickelt, um Moleküle in Zellen einzuschleusen, die im Gegensatz zu den eher ?passiv? wirksamen Bindungsproteinen eigene biochemische Aktivitäten aufweisen. Da eine kovalente Fusion von PTDs die funktionellen Eigenschaften von Molekülen beeinflussen kann, wurde ein besonderes Augenmerk darauf gelegt, Moleküle durch nicht-kovalente Kopplung an einen Transporter einzuschleusen. Hierfür wurden PTD-fusionierte SA- und Strep-Tactin-(ST-) Derivate, sog. ?Transvidine? und ?Transtactine?, als Transporter für Biotin- und/oder Strep-tag II-gekoppelte Moleküle entwickelt. Durch Produktion der Transvidine und Transtactine als unlösliche bakterielle Einschlusskörper konnte das Problem der geringen Ausbeute während der Produktion und Reinigung umgangen werden, das für andere PTD-gekoppelte Proteine beobachtet wurde. Die biophysikalische Charakterisierung der Transvidin- und Transtactin-Transporter ergab hohe thermische Stabilitäten und stabile Sekundärstrukturen. Dies zeigte, dass sowohl SA als auch ST überaus rigide Proteingerüste darstellen. Zellkulturstudien zeigten, dass beide Transportersysteme Biotin- und/oder Strep-tag II-gekoppelte niedermolekulare Moleküle, Peptide, Proteine sowie multifaktorielle Komplexe einfach, sicher und effizient in humane Zellen internalisierten. Anhand des Modellproteins Meerrettichperoxidase wurde außerdem demonstriert, dass Proteine durch Transvidine und Transtactine in funktionell aktiver Form eingeschleust werden können. Diese Ergebnisse zeigen, dass Transvidine und Transtactine als universelle und effiziente Transportersysteme für die Internalisierung von Biotin- und Strep-tag II-gekoppelten Molekülen in Säugerzellen dienen können. 
KW  - Strep-Tactin 
KW  -  Strep-tag 
KW  -  ProteintransduktionsdomäneStreptavidin 
KW  -  Strep-Tactin 
KW  -  Strep-tag 
KW  -  Protein transduction domain 
KW  -  Internalization
A1  - Moosmeier, Markus Andreas
AV  - public
TI  - Development of Universal Transmembrane Transporter Systems
Y1  - 2009///
ER  -