eprintid: 9870
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status_changed: 2012-08-15 08:49:46
type: doctoralThesis
metadata_visibility: show
creators_name: Marguerre, Ann-Kathrin
title: Synthese und bioanalytische Anwendung Lanthanid-markierter Peptide und Nucleinsäuren
title_en: Synthesis and bioanalytical application of lanthanide-based peptides and nucleic acids
ispublished: pub
subjects: ddc-540
divisions: i-120200
adv_faculty: af-12
keywords: lanthanides, fluorescence resonance energy transfer, peptidase, time-resolved fluorescence  DNA-detection, PNA
cterms_swd: Lanthanoide
cterms_swd: Fluoreszenz
cterms_swd: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
cterms_swd: Verzögerte Fluoreszenz
cterms_swd: DNS
cterms_swd: Proteasen
cterms_swd: Peptid-Nucleinsäuren
abstract: Die Arbeit behandelt die Entwicklung neuer Lanthanidsonden und ihre Anwendung zur Detektion von Nucleinsäuren und Enzymen durch zeitaufgelöste Lumineszenzmessungen. Zum einen wurden dazu Lanthanidkomplex-modifizierte fluorogene Peptidsubstrate, zum anderen Chelator-modifizierte Peptidnucleinsäuren (PNAs) synthetisiert. Im funktionalisierten Peptidsubstrat wird die Lumineszenz des Lanthanidkomplexes durch einen Bis-Azo-Farbstoff (Black Hole Quencher) vollständig gelöscht. Die enzymatische Spaltung des Substrats führt zu einer räumlichen Trennung von Komplex und Quencher und so zu einem deutlichen Signalanstieg. Durch zeitaufgelöste Messung der langlebigen Lanthanidlumineszenz kann Thermolysin sehr empfindlich nachgewiesen werden.  Darüber hinaus wurden die besonderen photophysikalischen Eigenschaften der Lanthanidkomplexe zur Detektion von DNA eingesetzt.  An beiden Termini mit Chelatoren modifizierte Peptidnucleinsäuren wurden entwickelt und ihre Wechselwirkung mit komplementärer DNA untersucht. Diese führt zur allosterischen Destabilisierung eines zuvor gebildeten zirkularen PNA-Lanthanidkomplexes, wodurch das Metallion freigesetzt wird und mit Hilfe von Sensitizern detektiert werden kann.  In einem zweiten auf Signalverstärkung beruhenden Ansatz zur Detektion von DNA fungiert ein zirkularer DNA-Zink-Komplex als Primärsonde für eine komplementäre Ziel-DNA. Auch hier wird das Metallion durch Hybridisierung freigesetzt, jedoch anschließend nicht direkt, sondern indirekt über die Aktivierung eines Zn2+-Cofaktor abhängigen Enzyms Thermolysin nachgewiesen. Eine Signalamplifikation erfolgte katalytisch über die Spaltung des oben beschriebenen fluorogenen Peptidsubstrats, welches ein starkes Lumineszenzsignal erzeugt.  
abstract_translated_text: The thesis covers the development of new lanthanide-based probes and their application to the detection of DNA sequences and enzymes by time-resolved luminescence measurements. Both lanthanide-based fluorogenic peptide substrates and chelator-functionalized peptide nucleic acids (PNAs) were synthesized. Luminescence of a lanthanide complex attached to an oligopeptide was efficiently quenched intramolecularly by a bis(azo)dye (black hole quencher 2). Enzymatic hydrolysis of this substrate leads to a spatial separation of complex and quencher and results in a significant increase of the luminescent signal. Application of time-resolved techniques enables the highly sensitive detection of the metalloendoprotease like thermolysin. The unique photophysical properties of lanthanide complexes were also advantageous for the detection of DNA.  Peptide nucleic acids bearing chelating groups on both termini were prepared. Their interaction with complementary DNA results in an allosteric destabilization of a preformed PNA-lanthanide complex, which causes the release of the bound metal ion. The latter is detected by formation of a luminescent complex with a sensitizing ligand.  Finally, DNA was detected by enzyme-triggered amplification of a luminescent lanthanide signal. In this approach, the DNA target first hybridizes with a circular DNA-zinc complex. The released Zn2+ ion acts as a cofactor for an apoenzyme (apothermolysin), resulting in an active holoenzyme. The active enzyme catalyzes the cleavage of above mentioned luminescent peptide substrate. Thus, the signal can be monitored fluorometrically using time-resolved techniques, allowing the detection of target DNA with high sensitivity and sequence specificity.  
abstract_translated_lang: eng
date: 2009
date_type: published
id_scheme: DOI
id_number: 10.11588/heidok.00009870
ppn_swb: 611915073
own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-opus-98709
date_accepted: 2009-09-21
advisor: HASH(0x55fc34e9f038)
language: ger
bibsort: MARGUERREASYNTHESEUN2009
full_text_status: public
citation:   Marguerre, Ann-Kathrin  (2009) Synthese und bioanalytische Anwendung Lanthanid-markierter Peptide und Nucleinsäuren.  [Dissertation]     
document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/9870/1/Ak.Marguerre_Dissertation.pdf