English Title: Functional Interactions in the Nuclear Envelope : Lamin B-Receptor and Lamin A

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Abstract

Die Suche nach neuen Interaktionspartnern für LBR und Lamin A sollte Faktoren ermitteln, durch die sich Veränderungen des Chromatins und der Kernmorphologie erklären lassen, wie sie für die erblichen Krankheiten Pelger-Huët-Kernanomalie und die Progerie (HGPS) beobachtet werden. Mit dem LBR-N-Terminus durchsuchten wir eine „Yeast-Two-Hybrid“-Bibliothek aus einer zu Granulozyten differenzierenden promyeloiden Zelllinie zwei Tage nach Induktion mit Retinsäure. Das Genexpressionsmuster für LBR zeigte zu diesem Zeitpunkt einen deutlichen Anstieg der LBR-Expression, während die Lamin A-mRNA-Menge relativ konstant blieb. Für LBR konnten wir eine bereits beschriebene Interaktion mit HP1a und HP1gamma; bestätigen und für HP1b neu zeigen. Die Wechselwirkung mit HIPK2, einer an verschiedenen Signaltransduktionswegen beteiligten Kinase, konnte für die Interaktion mit der Kinase-inaktiven Mutante und mit der nicht-sumoylierbaren Mutante sowie mit einem N-terminalen und einem C-terminalen Fragment bestätigt werden, nicht jedoch mit der HIPK2 selbst. Einige der gefundenen Faktoren, darunter PCBP1, U2AF und UBE21, können dem Spleißprozess zugeordnet werden. Für Lamin A, B1, B2 und LBR durchsuchten wir darüber hinaus eine Hefe-Bibliothek, die aus etwa 5000 zerebralen Faktoren zusammengesetzt war. Eine positive Wechselwirkung wurde für LBR und FAC1, einem DNA-bindenden Protein, im Bereich der ersten globulären nucleoplasmatischen Domäne von LBR sowie einem Bereich des C-Terminus gefunden. Mit der C-terminalen Domäne von Lamin A, die den 50 fehlenden Aminosäuren in HGPS Patienten entspricht, wurden 31 Kandidaten gefunden. Eine starke Wechselwirkung von Lamin A wurde mit den nucleären Proteinen RBBP4, TUSC4, TUBA1, PTN1 und CKN1 über einen GST-vermittelten Interaktionstest unter physiologischen Bedingungen ermittelt. Weiterführende Untersuchungen mit RBBP4 zeigten, dass durch die gestörte Interaktion von RBBP4 mit Lamin A in HGPS- und in normalen Zellen vermehrt Schäden in der Chromatin Organisation sowie der DNA hervorgerufen werden. Die Interaktion von Lamin A mit Proteinen des NURD-Komplexes wie RBBP4 scheint für den Alterungsprozess sowohl in HGPS-Zellen als auch in normalen Zellen von Bedeutung zu sein. In dieser Arbeit konnte somit das Netzwerk der Interaktionspartner für Lamin A und LBR erweitert werden und dessen weitreichende Auswirkung auf Prozesse im Kern insbesondere für die Chromatinorganisation gezeigt werden.

Translation of abstract (English)

The search for new interacting proteins for lamin B-receptor (LBR) and lamin A should reveal protein factors, that explain changes in chromatin organization and nuclear mor-phology as observed for hereditary diseases such as Pelger-Huët-Anomaly and progeria, i.e. the Hutchison-Gilford-Progeria-Syndrome (HGPS). A LBR-amino-terminal construct was used to screen a “Yeast –Two-Hybrid”-library that was gained from a promyeloid cell line (HL60) in the course of differentiation to granulocytes two days after induction with retinoic acid. At this time the mRNA expression showed an increase of LBR-mRNA whereas the lamin A-mRNA remained mostly unchanged. For LBR we confirmed the published interaction with HP1a and HP1γ. Moreover, we could newly show that HP1gamma; also interacts with LBR. The interaction with HIPK2, a kinase involved in several signal transduction pathways, was confirmed only for the kinase inactive mutant and for the sumoylation-deficient mutant but not with HIPK2 itself. Three interacting proteins were related to the splicing process, among those were the proteins PCBP1, U2AF and UBE21. For lamin A, B1, B2 and LBR we searched within a yeast-library composed of more than 5000 cerebral factors for specific interactions. A positive interaction for LBR with FAC1, a DNA-binding protein, was confirmed for the first globular domain of LBR and additionally for the C-terminal nucleoplasmatic domain. Furthermore, the carboxy-terminal domain of lamin A, corresponding to the 50 carboxy-terminal amino acids of lamin A that are missing in HGPS patients, we yielded 31 candidates. The interactions for Lamin A with RBBP4, TUSC4, TUBA1, PTN1 and CKN1 were confirmed under physiological conditions by the GST-pulldown method. Further investigations for RBBP4 as a part of the NURD chromatin remodelling complex showed by disturbing the interaction of RBBP4 and lamin A, that damage of chromatin organization and DNA significantly increased in both HGPS cells and normal cells. Thus, the interaction of lamin A with proteins of the NURD-Komplex, such as RBBP4, is involved in ageing related processes in HGPS cells and in normally aged cells. In this work we were able to extend the network of interactions for lamin A and LBR and to show its impact on nuclear processes in particular for chromatin organization.