English Title: Characterization of the function of the guanine nucleotide exchange factor RhoGEF17 in smooth muscle cells

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Abstract

Die monomere GTPase RhoA und der Signalmediator cGMP sind in vaskulären glatten Muskelzellen entscheidend an der Regulation verschiedener Prozesse wie Kontraktion, Relaxation und Differenzierung beteiligt. In Vorarbeiten wurde gezeigt, dass der Guaninnukleotid-Austauschfaktor RhoGEF17 in glatten Muskelzellen der Rattenaorta exprimiert wird und dort für die Vermittlung einer cGMP-induzierten Aktivierung von RhoA verantwortlich ist. Basierend auf diesen Daten war es das Ziel dieser Arbeit die basale sowie die cGMP-abhängige Funktion von RhoGEF17 in isolierten glatten Muskelzellen der Rattenaorta (RASMC) näher zu untersuchen. Außerdem sollte geklärt werden, ob die Expression von RhoGEF17 auch in trachealen glatten Muskelzellen von Bedeutung ist. Hierfür wurde die endogene Expression von RhoGEF17 mit Hilfe eines shRNA-Adenovirus in den Zellen reduziert. Dabei zeigte sich, dass die Verminderung des RhoGEF17-Proteingehalts sowohl in vaskulären als auch in trachealen glatten Muskelzellen mit einer Veränderung der Zellmorphologie, dem Verlust von Actin-Stressfasern sowie einer verminderten Expression der GTPase RhoA einherging. Zudem führte die shRNA-vermittelte partielle Depletion von RhoGEF17 zu einer signifikanten Verzögerung des Adhäsionsprozesses der glatten Gefäßmuskelzellen sowie zu einer deutlich verringerten Proliferation von trachealen glatten Muskelzellen. In weiteren Untersuchungen konnte auch die bereits in den Vorarbeiten beschriebene cGMP/RhoGEF17-vermittelte Aktivierung von RhoA in vaskulären glatten Muskelzellen reproduziert werden. In diesem Zusammenhang konnte zudem gezeigt werden, dass die adenovirale Überexpression der cGMP-abhängigen Kinase cGKI, welche für die Aktivierung von RhoGEF17 verantwortlich ist, in den RASMC eine zusätzliche Steigerung der cGMP-induzierten RhoA-Aktivierung hervorruft. In trachealen glatten Muskelzellen führte die Stimulation mit cGMP dagegen nicht zu einer Aktivierung von RhoA. Weiterführende Experimente zur Untersuchung der physiologischen Relevanz des cGMP/cGKI/RhoGEF17-Signalweges in glatten Gefäßmuskelzellen zeigten schließlich, dass cGMP in RASMC mit verminderter RhoGEF17-Expression keine Relaxation hervorrufen konnte. Die Serum-induzierte Kontraktion wurde durch die partielle Depletion von RhoGEF17 dagegen nicht beeinflusst. Desweiteren hatte cGMP, welches unter Kontroll-Bedingungen die Adhäsion der isolierten glatten Gefäßmuskelzellen förderte, keinen Einfluss auf die Adhäsionsgeschwindigkeit von RASMC mit reduzierter Expression von RhoGEF17. Zusammengenommen deuten die erhobenen Daten darauf hin, dass RhoGEF17 in vaskulären sowie trachealen glatten Muskelzellen für die Erhaltung der Zellintegrität von Bedeutung ist und speziell in Gefäßmuskelzellen eine Rolle bei der Vermittlung cGMP-abhängiger Signale übernimmt.

Translation of abstract (English)

The monomeric GTPase RhoA and the second messenger cGMP play important roles in the regulation of different processes in vascular smooth muscle cells like contraction, relaxation and differentiation. Preliminary work in our group identified the guanine nucleotide exchange factor RhoGEF17 as a mediator of a cGMP-induced activation of RhoA, which is expressed in vascular smooth muscle cells. Based on this data the present work aimed to investigate the function of RhoGEF17 in vascular as well as in tracheal smooth muscle cells. Therefore, the endogenous expression of RhoGEF17 in isolated rat aortic and tracheal smooth muscle cells was suppressed by an adenovirus encoding a specific shRNA targeting RhoGEF17 mRNA. The knockdown of RhoGEF17 resulted in a change of smooth muscle cell morphology, a loss of actin stress fibers and a decreased expression of the GTPase RhoA. Moreover the expression level of RhoGEF17 influenced the attachment of vascular smooth muscle cells to a surface after detachment and affected the proliferation of tracheal smooth muscle cells. The knockdown experiments confirmed the requirement of RhoGEF17 for the cGMP-induced activation of RhoA in vascular smooth muscle cells. Overexpression of the cGMP-dependent kinase cGKI, which activates RhoGEF17 through phosphorylation, caused an additional increase in the cGMP induced RhoA activity. A stimulation of tracheal smooth muscle cells with cGMP, however, did not elicit an activation of RhoA. Several lines of evidence for a physiological relevance of the cGMP/cGKI/RhoGEF17 signaling pathway in vascular smooth muscle cells were obtained. Knockdown of RhoGEF17 ablated cGMP-induced relaxation in a 3D culture model of vascular smooth muscle cells whereas the contraction in response to serum was not affected. With regard to cell adhesion, cGMP stimulated the attachment of isolated vascular smooth muscle cells to a surface under control conditions, but had no effect on the adhesion process of cells with a reduced expression of RhoGEF17. In summary, the data collected indicate that RhoGEF17 is required for the regulation of vascular as well as tracheal smooth muscle cell integrity. Especially in vascular smooth muscle cells, it additionally plays a role as a mediator of cGMP-dependent signaling.