German Title: Zur Struktur und Funktion des COPI Hüllproteinkomplexes Coatomer

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Abstract

In eukaryotes newly synthesized proteins and membranes in the early secretory pathway are transported by COPII and COPI vesicles. The key componets for the formation of COPI vesicles are the small GTPase Arf1 and the Coatomer complex. Coatomer is recruited to the donor mebrane by GTP-loaded Arf. On the membrane, coatomer polymerizes and deforms the membrane into a coated bud, which can then pinch of to form a free COPI vesicle. Prior to fusion of a vesicle with its target membrane, the coat is removed from the carrier by hydrolysis of GTP in Arf1. In this work I investigated the structure of the coatomer complex and its interaction with the small GTPase Arf1. To this end I decided to use coatomer and Arf derieved from the thermophilic ascomycete Chaetomium thermophilum, as proteins from this organism have proven more suitable for structural investigations as proteins from mesophilic organisms. We were able to produce coatomer from Chaetomium thermophilum and showed that it produces COPI vesicles. Also we prepared coatomer variants lacking the e-COP subunit and the C-terminal m-homology domain of d-COP. e-COP and the m-homolgy domain of d-COP have been implicated in forming contacts between coatomer triads on COPI-vesicles to stabilize the coat on the membrane. Surprisingly both coatomer variants retained the ability to produce vesicles. The structure of the coatomer complex was only partially solved at the atomic level. In this work we were able to solve the structure of a bd-subcomplex of coatomer. The structural information of this complex closes the largest gap in our knowledge of atomic coatomer structure. The structure shows a close homology to gz-COP. The N-terminal part of g-COP and b-COP both form curved a-solenoid folds, whereas z-COP and the N-terminal part of d-COP form longin-like folds. Our structure reveals that an extended linker region of d-COP passes below the a-solenoid of b-COP. The passage of the linker is close to an assumed binding site of the small GTPase Arf1 on b-COP, implicating a potential function of the linker in Arf-binding. Two major binding sites on coatomer for Arf are implicated in the initial recruitment of the coat complex. One site is situated on g-COP and the other on b-COP. In addition, the d-COP subunit had been reported to bind Arf. We show here that the affinity of bd-subcomplexes to bind Arf is increased by incorporation of the first two a-helices of the linker region of d-COP. This data revealed that b-COP and d-COP bind to the same Arf molecule.

Translation of abstract (German)

Die Schlüsselkomponenten für die Bildung von COPI Vesikeln sind die kleine GTPase Arf und der heptamere Coatomer Komplex. Arf in seiner GTP-geladenen Form rekrutiert Coatomer an die Membran. Auf der Membran polymerisiert Coatomer und deformiert diese bis zur Bildung einer Vesikelknospe. Diese muß sich von der Membran abschnüren, um ein freies COPI Vesikel zu bilden. Vor der Fusion des Vesikels mit seiner Zielmembran wird die Proteinhülle des Vesikels durch GTP-Hydrolyse in Arf abgelöst. In dieser Arbeit wurde die Struktur des Coatomer Komplex sowie seine Interaktionen mit der kleinen GTPase Arf1 untersucht. Dazu entschied ich mich, Coatomer und Arf aus dem thermophilen Askomyceten Chaetomium thermophilum zu verwenden, da gezeigt wurde, dass Proteine dieses Organismus für strukturelle Untersuchungen besser geeignet sind, als Proteine aus mesophilen Organismen. Coatomer aus Chaetomium thermophilum wurde hergestellt. Die Funktionalität des hergestellten Coatomers wurde durch seine Fähigkeit, Vesikel zu bilden, nachgewiesen. Zusätzlich wurden Coatomer Varianten erzeugt, denen entweder die e-COP Untereinheit oder die C-terminale m-Homologie Domäne der d-COP Untereinheit fehlten. e-COP und die m-Homologie Domäne von d-COP sollen für die Ausbildung von Kontakten zwischen Coatomer Triaden auf dem COPI Vesikel verantwortlich sein und auf diese Weise die Proteinhülle auf dem Vesikel stabilisieren. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass beide Varianten des Coatomer Komplexes noch Vesikel bilden konnten. Die hochauflösende atomare Struktur des Coatomer Komplexes war nur teilweise bekannt. In dieser Arbeit konnte die Struktur eines bd-Subkomplexes gelöst werden. Die strukturelle Information dieses Komplexes schließt die größte, in der atomaren Struktur des Coatomer Komplexes noch vorhandene Lücke. Die gelöste Struktur zeigte eine große Ähnlichkeit zu gz-COP. Die N-terminalen Teile von g-COP und b-COP bilden geschwungene a-Solenoid Strukturen aus. z-COP und der N-terminale Teil von d-COP bilden eine longin-artige Stuktur. Durch die hohe Auflösung zeigte sich, dass der lange Linker-Bereich von d-COP unterhalb des a-Solenoids von b-COP hindurchläuft. Der Linker-Bereich tritt in dem Bereich unter dem a-Solenoid von d-COP hindurch, an dem die Bindungsstelle für die kleine GTPase Arf vermutet wird. Dies impliziert eine potentielle Funktion des Linkers in der Bindung und Stabilisierung von Arf. Es gibt zwei Bindungsstellen im Coatomer Komplex für Arf, die für die initiale Rekrutierung von Coatomer zuständig sind. Eine Bindungsstelle befindet sich auf g-COP, die andere auf b-COP. Es wurde aufgrund biochemischer Ergebnisse berichtet, dass d-COP Arf binden kann. In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass die Bindungsaffinität von bd-Subcomplexen für Arf ansteigt, wenn die ersten beiden a-Helices der Liker-Region von d-COP vorhanden sind. Daraus können wir schließen, dass b-COP und d-COP an ein und dasselbe Arf-Molekül binden.