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Abstract

The capability to sense and transduce environmental as well as internal sensory stimuli, such as touch, pain or muscle tension, is a fundamental process required for cell survival and the avoidance of tissue damage of the body. Vertebrates can detect these stimuli via specialized cells in the peripheral nervous system - the somatosensory neurons. It is well known that the peripheral nervous system consists of many different types of neurons, but how they are generated and how they establish their functional abilities is at present not fully understood. Although pain sensation represents an adaptive alarm system detecting signals that are potentially harmful to the body, persistent pain is a maladaptive false alarm and nowadays clinicians have only few, if any, effective means to medicate chronic pain. Therefore, it is indispensable to get a more detailed understanding of how pain signals are transmitted and how human pain-sensitive neurons are established, given that most of the current knowledge about pain or pain sensation is based on animal studies. Although animal models provided a basis for research about causes, onset and course of pain diseases, there is more and more evidence that the translation of these findings to human patients is more challenging than expected. Therefore, the aim of this Ph.D. thesis was to establish a differentiation protocol for the generation of functional human embryonic stem cell (hESC)-derived nociceptors. I found that a transient overexpression of the bHLH transcription factor neurogenin 1 (NGN1), known to induce neurogenesis and to mediate the differentiation of nociceptive neurons in mice, was sufficient to differentiate progenitor cells of the peripheral nervous system (PNS) into primary sensory neurons with a nociceptive phenotype. Differentiated cells were analyzed and characterized by using Ca2+-imaging, immunohistochemistry, in situ hybridization, quantitative RT-PCR and electrophysiological recording techniques, confirming their nociceptor-like properties. To validate whether hESC-derived nociceptors are physiologically relevant and can reflect the in vivo equivalent, we compared them to human post-mortem DRG tissue where we found a similar marker gene profile. A comparative study that I carried out using human and mouse post-mortem DRG tissue highlighted molecular differences of murine and human sensory neurons that need to be considered when using the mouse as a model system for the development of new analgesic drugs. Furthermore, we were also interested in exploring the role of PIEZO2 in sensory neurons. Recent findings in rodents identified PIEZO2, a large transmembrane protein, as a main transducer of innocuous mechanical stimuli, and we confirmed that PIEZO2 is also required for mechanotransduction in human stem cell-derived touch receptors. However, it is so far uncertain whether PIEZO2 also plays a role in transducing noxious mechanical stimuli to trigger sensation of pain. Rapidly-adapting, mechanically-activated currents (at least those conventionally recorded when using a nanomotor-driven stimulus probe) appeared to be absent in PIEZO2-knockout (KO) nociceptors, indicating that PIEZO2 is also required for mechanotransduction in stem cell-derived nociceptors. Additionally, I also aimed to identify accessory proteins of PIEZO2 that are involved in human PIEZO2-mediated sensory mechanotransduction, by generating a PIEZO2-tagged hESC line. The outcome of this study would allow us to identify differences and similarities between human and mouse nociceptors and furthermore, to use this differentiation protocol as a basis for the generation of other distinct human nociceptive subpopulations, to finally provide a model system to study human pain and pain transduction in vitro.

Translation of abstract (German)

Die Fähigkeit sensorische Reize, wie zum Beispiel Berührung, Schmerz oder Muskelanspannung, wahrnehmen und weiterleiten zu können, ist ein grundlegender Vorgang des Körpers, der für das Überleben der Zellen und die Vermeidung von Gewebeschädigungen erforderlich ist. Wirbeltiere können diese Reize durch spezielle Zellen, den somatosensorischen Neuronen, im peripheren Nervensystem erkennen. Es ist allgemein bekannt, dass das periphere Nervensystem aus vielen verschiedenen Arten von Neuronen besteht, jedoch ist nicht vollständig geklärt wie sie entstehen und wie sie ihre funktionalen Fähigkeiten erlangen. Obwohl die Schmerzwahrnehmung ein anpassungsfähiges Alarmsystem darstellt, welches für den Körper möglicherweise gefährliche Signale erkennt, ist ein andauernder Schmerz ein „Falschalarm“ und es gibt nur wenige, wenn überhaupt, wirksame Medikamente, um chronische Schmerzen zu behandeln. Daher ist es wichtig, eine genauere Erkenntnis zu bekommen, wie humane schmerz-sensitive Neurone entstehen und wie Schmerzsignale übertragen werden, denn fast alles, was bisher über Schmerz oder Schmerzwahrnehmung bekannt ist, basiert auf Studien mit Tieren. Obwohl Tiermodelle als Grundlage zur Erforschung der Ursachen, Entstehung und des Verlaufs von Krankheiten gedient haben, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass das Übertragen der Ergebnisse dieser Tierstudien auf den menschlichen Organismus schwieriger ist als erwartet. Das Ziel dieser Dissertation war es, ein Differenzierungsprotokoll zu etablieren um humane embryonale Stammzellen in funktionale Nozizeptoren zu differenzieren. Eine transiente Überexpression des Transkriptionsfaktors Neurogenin 1 (NGN1), der bekannt dafür war, Neurogenese zu induzieren und die Differenzierung von Nozizeptoren in der Maus zu vermitteln, war ausreichend um periphere, neuronale Vorläuferzellen in primäre sensorische Neurone mit nozizeptiven Eigenschaften zu differenzieren. Differenzierte Zellen wurden anhand von kalziumbasierten Bildgebungsverfahren, Immunhistochemie, in situ-Hybridisierung, quantitativer PCR und elektrophysiologischer Ableitungen charakterisiert, was ihre nozizeptiven Eigenschaften bestätigte. Um zu überprüfen, ob Stammzell-abgeleitete Nozizeptoren physiologisch relevant sind und sie den humanen in vivo Nozizeptoren entsprechen, wurden sie mit humanem post-mortem Hinterwurzelganglion-Gewebe (DRG-Gewebe) verglichen, wobei ein ähnliches Markergen-Profil zu erkennen war. Eine Vergleichsstudie zwischen Mensch und Maus DRG-Gewebe zeigte, dass bereits auf Ebene der primären sensorischen Neuronen molekulare Unterschiede existieren, die bei der Entwicklung neuer Schmerzmedikamente in Betracht gezogen werden müssen. Darüber hinaus waren wir daran interessiert, welche Rolle PIEZO2 in sensorischen Neuronen spielt. In Tierstudien konnte gezeigt werden, dass PIEZO2, ein großes Transmembranprotein, als einer der „Haupt-Überträger“ von sanften mechanischen Reizen dient, und wir konnten bestätigen, dass PIEZO2 auch für die Mechanotransduktion in humanen Stammzell-abgeleiteten Tastrezeptoren erforderlich ist. Bisher war jedoch ungewiss, ob PIEZO2 auch eine Rolle bei der Transduktion von schmerzhaften mechanischen Reizen spielt. PIEZO2-defiziente Nozizeptoren zeigten keine schnell adaptierenden, mechanisch-aktivierbaren Ströme (zumindest keine, die man üblicherweise mit einer motorgetriebenen Sonde misst), was darauf hindeutete, dass PIEZO2 auch für die Mechanotransduktion in differenzierten Nozizeptoren notwendig ist. Des Weiteren suchten wir mit Hilfe einer humanen Protein-Tag markierten PIEZO2 Stammzelllinie nach Interaktionspartnern von PIEZO2, die an der humanen PIEZO2-vermittelten sensorischen Mechanotransduktion beteiligt sind. Das Ergebnis dieser Studie ermöglicht es uns, Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen Mensch und Maus Nozizeptoren zu identifizieren und dieses Differenzierungsprotokoll als Grundlage weiterer Differenzierungsprotokolle zu nutzen, um endlich ein Modellsystem bereitzustellen um Schmerz und humane Schmerz-Transduktion in-vitro untersuchen zu können.